研究背景及目的血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管发展而形成新的血管,是机体维持新陈代谢,修复机体损伤的重要途径。血管形成是促血管形成因子(pro-angiogenesis)和抑制血管形成因子(anti-angiogenesis)协调作用的复杂过程,二者正常下处于平衡状态,许多疾病的产生可以归结为此平衡打破而出现的血管生成过度(癌症、关节炎、动脉粥样硬化、视网膜病变等)或血管生成不足(心脏大脑的周围性缺血、高血压、糖尿病、肾病等)。血管内皮生长因子(VEGF, vascular endothelial growth factor)及其受体系统VEGFR1(vascular endothelial growth factor receptor1)和VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor2)是体内最重要的调节血管生成的因子之一。VEGFR1与VEGFR2是VEGF主要效应受体,主要表达于血管内皮细胞,或某些非血管细胞如如造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞、血小板前体、神经细胞,与VEGF结合后调控血管生成、血管维护、内皮细胞迁移、调控血管渗透性和扩张血管。VEGFR2被认为是作用最强的促血管生长的因子,与VEGF结合后发挥促进血管增生作用,VEGFR1与VEGF的结合力强于VEGFR2,但是促血管生成能力却远弱于VEGFR2,因为拮抗了VEGFR2的作用,因此VEGFR1被认为是抑制血管增生的因子。膜联蛋白VEGFR1全长是180kDa,易分解成为约110kDa的可溶的剪切片段sVEGFR1(soluble vascular endothelial growth factor receptor1)。sVEGFR1极易与VEGF结合,阻碍了VEGF与VEGFR2的结合,从而阻断了一系列促进血管生长的途径,发挥抑制血管生长的作用,被认为是抗血管形成作用最强的因子。sVEGFR1的强效抑制血管生成作用在临床上有极大的应用潜力,例如：许多血管生成异常方面的疾病可以把sVEGFR1作为检测物,也可以把sVEGFR1作为治疗血管增生过度疾病的治疗载体。分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联(cascade)对细胞的生长、分化、凋亡、炎症反应及细胞应对外界刺激的一系列行为中有及其重要的作用。现在已知MAPK家族有四大信号传导通路：C-Jun基末端激酶(JNK,c-Jun N-terminal kinase)-应激活化蛋白(SAPK, stress-activated protein kinase,)途径,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK, extra cellular signal-regulated protein kinase,)途径,ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶(BMK1,big MAP MAP kinase)途径和p38MAPK (p38MAPK, p38mitogen activated protein kinase)传导途径。p38MAPK信号通路是1993年,当细菌脂多糖(LPS)诱导转染有CD14基因的小鼠前B淋巴细胞、单核巨噬细胞系RAW264.7和C3HeB/FeJ(LPS+)时人们发现巨噬细胞的p38MAPK分子酪氨酸磷酸化,从而发现了p38MAPK通路。p38MAPK通路在LPS介导的炎症反应和调控机制中有重要作用。此外人们在对肿瘤的研究中发现,p38MAPK通路可能参与了肿瘤的发生、增殖、运动,并在调控细胞外基质降解和肿瘤细胞血管形成中有着重要作用。生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45(growth arrest and DNAdamage inducible protein45,Gadd45)家族是机体对外界物理和环境压力反应出的一种压力信号,Gadd45基因很小,由18kDa编码,其家族成员包括gadd45a、gadd45b、gadd45g,各成员的氨基酸序列有55%-58%的相似度,有很高的同源性,在细胞中分布广泛(在细胞胞浆和胞核中都能找到)。Gadd45蛋白常由环境变化、理化条件变化(如甲基甲烷磺酸酯、辐射、紫外线、柔红霉素)和炎症因子刺激产生。作为外界压力刺激的传感器,Gadd45a产生理化变化或与其他蛋白相互作用,其作用结果就是对细胞周期进行自我调节：使细胞周期停滞、DNA修复、或使细胞凋亡。Gadd45蛋白对体内肿瘤的发生有重要的抑制调控作用,如Gadd45蛋白缺失的老鼠基因突变几率大大增加,并易对电离辐射敏感而发生肿瘤；人类的乳腺癌、垂体腺瘤、肝癌等肿瘤的发生可能与Gadd45蛋白启动子甲基化使得Gadd45功能失常有关。Gadd45蛋白在炎症免疫反应中亦有重要作用,Gadd45蛋白缺失易使小鼠患狼疮样自体免疫疾病,树突状细胞中Gadd45a缺失时会使Thl细胞极化反应消失。因此当外界条件诱使细胞发生外形或功能改变时,Gadd45的表达已成为人们关注的热点之一。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前所知体内功能最强的专职抗原提呈细胞(APC,antigen-presenting cell),能启动特异性免疫应答及激活未致敏的初始型T细胞,在炎症免疫及肿瘤治疗的研究中有特殊的意义。自然状态下大部分人体内DC细胞是非成熟状态,受到抗原刺激后,分化成熟、呈递抗原、激发免疫应答。有文献研究认为推测DC细胞与内皮细胞系统之间有“cross-talk"可以调节血管生成,本文的目的是研究在单核细胞受到刺激向未成熟DC细胞发育的过程中,研究代表血管生成性质的重要因子VEGF、VEGFR1及sVEGFRl的表达变化,加入的细胞刺激因子IL-4和GM-CSF对这些变化产生的影响和p38信号通路在此过程中所起作用,以及sVEGFRl表达变化与Gadd45a基因的关系,这些将成为研究DC发育过程中的血管系统变化和Gadd45表达变化的重要组成部分,这些研究对于基础和临床上关于炎症、肿瘤治疗的药物载体、作用靶点将有重要意义。材料与方法：第一部分：1为了模拟未成熟DC发育过程,我们采用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7加入细胞因子IL-4和GM-CSF联合刺激的方法,取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养培养3天,在相差显微镜下观察细胞形态,并收集细胞约1-2×104个加CD86、CDllc、CD80及VEGFR1抗体以流式细胞学技术检测细胞表面表达CD86、CDllc、CD80的情况。2取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养培养3天,收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFR1表达,流式细胞学技术检测细胞表面VEGFR1蛋白表达。3取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,细胞培养液分别加入IL-4(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或GM-CSF(10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml),并设空白组(仅有RAW264.7细胞,无任何细胞因子),在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱中培养3天,收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFRl表达。第二部分：1取两组RAW264.7细胞分别以IL-420ng/ml或GM-CSF20ng/ml浓度加入培养液,在37℃常氧、含5%CO2条件下孵育15min,30min,1h,收集细胞,提取蛋白,以western blot技术检测细胞中P38磷酸化表达,以检验在细胞因子的刺激下细胞中是否有P38信号通路的激活。2取SB203580(1：1000)加入细胞培养液,将RAW264.7细胞在孵育箱中培养1h,去除含SB203580的培养液,重新加入按实验要求含不同刺激因子的培养液,在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱培养3天后收集细胞及细胞培养上清,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术、ELISA技术检测细胞VEGF mRNA、VEGFR1mRNA及蛋白、sVEGFRl表达。第三部分：1取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和(GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养3天,收集细胞,提取RNA或细胞蛋白,以PCR技术、western blot技术检测细胞Gadd45amRNA、gadd45a蛋白表达。2取RAW264.7细胞4×105个铺入六孔板,细胞培养液分别加入IL-4(10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或GM-CSF(10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml),并设空白组(仅有RAW264.7细胞,无任何细胞因子),在37℃含5%CO2常氧状态下孵育箱中培养3天,收集细胞,提取RNA,以PCR技术检测细胞Gadd45a mRNA表达。3采用RNA小干扰技术,用Gadd45a-SiRNA转染RAW264.7细胞使Gadd45a基因表达沉默,在要求时间内提取细胞RNA,检测转染效率,并将Gadd45a基因沉默后的RAW264.7细胞4x105个铺入六孔板,加入IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(20ng/ml)至DMEM细胞培养液,在常氧状态下37℃含5%CO2孵育箱中培养,规定时间内收集细胞及培养上清,提取细胞RNA,以PCR技术、ELISA技术检测细胞Gadd45基因表达正常或沉默条件下VEGFR1mRNA, sVEGFRl表达。结果：1细胞培养3天后相差显微镜下观察：加入细胞刺激因子IL-4和GM-CSF的细胞体积变大,胞核变大,细胞形态呈现多样化,并且伸出长长的伪足,形状类似不成熟树突状细胞(immature DC)流式细胞学技术检查细胞膜表面共刺激分子CDllc、CD86、CD80表达升高,表示RAW264.7在IL-4和GM-CSF联合刺激下向未成熟DC样细胞发育。2未成熟DC样细胞较RAW264.7细胞表达高水平的VEGFR1mRNA及VEGFR1蛋白,细胞膜表面VEGFR1蛋白表达无显著差异,sVEGFR1表达显著增高,但是VEGF mRNA表达下调,表明抗血管生成性能增加。3IL-4能提高RAW264.7细胞中VEGFR1mRNA和VEGFR1蛋白的表达及减少细胞膜表面膜联蛋白VEGFR1表达,上调sVEGFR1水平。GM-CSF没有增加VEGFR1mRNA表达,但提高VEGFR1的蛋白表达,膜联蛋白VEGFR1表达略有增高,sVEGFR1水平增加,增高幅度小于IL-4。两种刺激因子均对VEGF mRNA表达无明显影响。细胞因子剂量的不同对细胞因子的作用结果无显著差异。4两种细胞因子作用15min即可看到P38信号通路在RAW264.7细胞内开始激活。SB203580使得未成熟DC样细胞表达VEGFR1mRNA减少,但是sVEGFRl水平升高。SB203580使用后,IL-4和GM-CSF刺激RAW264.7细胞表达VEGFR1mRNA下降,IL-4刺激细胞表达sVEGFRl水平下降,但是GM-CSF却刺激细胞表达sVEGFR1水平略有上升,两种因子刺激后的细胞膜表面膜联蛋白VEGFR1表达较RAW264.7细胞无明显差别。5未成熟DC样细胞较RAW264.7细胞表达高水平的Gadd45a mRNA及Gadd45a蛋白。6Gadd45a基因沉默的未成熟DC样细胞较Gadd45a基因表达正常的未成熟DC样细胞表达下调的VEGFR1mRNA及sVEGFR1水平。结论1RAW264.7细胞在IL-4和GM-CSF联合刺激下,向未成熟DC样细胞发育的同时伴随着VEGFR1mRNA表达上调及sVEGFR1增高,但VEGF mRNA表达下降显示了在此过程中细胞的抗血管形成功能逐渐上升。2两种因子对细胞的sVEGFR1上调机制各不相同：IL-4能提高VEGFR1mRNA表达、VEGFR1蛋白的翻译及sVEGFR1水平,同时减少细胞膜上膜联蛋白VEGFR1表达,提示IL-4可能增强TACE活性从而增强其主导的胞外功能域脱落的蛋白水解作用,使得sVEGFR1表达增强。GM-CSF没有增加VEGFR1mRNA表达,但提高VEGFR1的蛋白表达,使得sVEGFR1水平增加。3IL-4刺激RAW264.7细胞的VEGFR1mRNA表达及sVEGFR1水平表达与P38信号通路密切相关；GM-CSF刺激RAW264.7细胞的sVEGFR1分泌增高有着多种信号通路的参与,其中SB203580可能与其他信号通路有cross-talk使得sVEGFRl分泌机理更复杂。4在RAW264.7细胞向未成熟DC样细胞发育的过程中,Gadd45a mRNA和Gadd45a蛋白表达增高,当RAW264.7细胞中Gadd45a基因表达沉默时,细胞的VEGFR1mRNA和sVEGFR1水平也有着显著下降。表明RAW264.7细胞向未成熟DC样细胞发育的过程中增强的抗血管形成能力的也部分由Gadd45a基因调控。