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研究目的证实脂毒背景下鼠胰腺β细胞膜G蛋白偶联受体119(GPR119)通过Ca2+-CaM活化MST1-FoxO1通路引起细胞功能损伤的途径和机制。研究方法1.经棕榈酸(PA)孵育大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1,采用MTT实验检测INS-1细胞存活率;采用蛋白免疫印迹实验(Western Blotting,WB)证实PA对Caspase-3及clCaspase-3的表达调节作用。2.GPR119激动剂MBX孵育INS-1细胞,通过MTT实验检测细胞存活率;运用流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡率和钙离子浓度的变化;运用细胞免疫化学法鉴定GPR119的分布及表达;运用WB检测GPR119,phospho-MST1,clMST1,MST1,phospho-FoxO1,FoxO1,Caspase-3,clC3 及 Pdx1 的表达水平;运用qPCR检测BCL-2,Bax,Pdx1及Insulin的mRNA表达;运用酶比色法检测INS-1细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及胰岛素的含量。3.Ca2+螯合剂EGTA和CaM抑制剂CPZ孵育INS-1细胞,通过MTT实验检测细胞存活率;运用流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡率;运用WB检测phospho-MST1,clMST1,MST1,phospho-FoxO 1 及 FoxO 1 的表达水平。4.采用pcDNA3-MST1过表达质粒及MST1 shRNA质粒转染正常和PA孵育 12hrs 后的 INS-1 细胞 72hrs,运用 WB 检测 phospho-MST1,clMST1,MST1,phospho-FoxO 1,FoxO1,Caspase-3,clC3 及 Pdx1 的表达水平。5.C57BL/6J小鼠80只分为10组,其中高/低脂饮食各5组持续喂养到第18周,期间记录投食量,摄食量并称重。在第12周检测胰岛素耐量和糖耐量,以判断造模进展。6.GPR119过表达载体的体内干预将构建成功的 pCDH-GFP、pCDH-GPR119、shCtrl、shGPR119 质粒经脂质体转染入HEK293T细胞,经过包装、扩增后,得到实验性的重组慢病毒。采用尾静脉注射技术,将重组慢病毒LV-GFP、LV-GPR119、LV-shCtrl、LV-shGPR119分别注入8组小鼠(高脂/低脂持续喂养第18周)尾静脉。一周后处死小鼠取胰腺组织采用免疫组织化学法观察各组胰岛细胞GPR119蛋白表达量,HE染色和电镜观察胰腺胰岛细胞损伤情况;运用酶比色法检测胰腺组织内游离脂肪酸、TG及胰岛素含量;运用WB检测各组小鼠胰腺组织内GPR119,phospho-MST1,clMST1,MST1,phospho-FoxO1,FoxO1,Caspase-3,clC3及Pdx1的表达水平。研究结果1.PA以浓度或时间依赖性增加INS-1细胞Caspase-3的表达WB 及 MTT 证实用 250.0uM/L 和 500.0uM/L PA 分别孵育 INS-1 细胞 12hrs,PA以浓度依赖性增加Caspase-3的表达水平;250.OuM/L PA分别孵育INS-1细胞 Ohr、1hr、3hrs、6hrs、12hrs、24hrs、48hrs,PA 以时间依赖性增加 Caspase-3及clCaspase-3的表达水平。2.250.0uM/LPA 孵育 INS-1 细胞 12hrs后,GPR119 激动剂 MBX 4.0uM/L干预细胞10min,检测到细胞内TG,FFA含量降低;WB结果显示MBX抑制了 MST1和FoxO1的磷酸化表达;qPCR结果显示经PA诱导后加GPR119激动剂MBX降低细胞内Bax的mRNA表达,同时Pdx1和Insulin的mRNA表达增加。3.WB实验结果显示细胞外的Ca2+对MST1的磷酸化表达没有明显影响;经 250.0uM/L PA 处理 INS-1 细胞 12hrs 后,CaM 抑制剂 CPZ 100.0uM/L 作用60min,WB实验结果显示CPZ增加了 MST1和FoxO1的磷酸化表达水平。4.pcDNA3-MST1过表达质粒及MST1 shRNA质粒分别转染正常培养和PA孵育12hrs后的INS-1细胞72hrs,WB实验结果显示MST1过表达增加了MST1的磷酸化表达和FoxO1的磷酸化表达;MST1 shRNA明显抑制了 MST1的磷酸化表达和FoxO1的磷酸化表达。5.高脂诱导C57BL/6J小鼠,尾静脉注射GPR119,GPR119 shRNA慢病毒一周后,采用HE染色和电镜观察到GPR119过表达组胰腺胰岛细胞较GPR119 shRNA组损伤程度轻,血清甘油三酯及游离脂肪酸含量降低,血清胰岛素水平增加,注射慢病毒一周后HFD-LV-GPR119较HFD-LV-shGPR119组葡萄糖耐量和胰岛素耐量均降低。WB结果显示GPR119过表达抑制了磷酸化的MST1及FoxO1的表达水平。研究结论1.脂毒背景下激活GPR119缓解胰腺β细胞功能损伤。2.脂毒背景下,GPR119可通过Ca2+-CaM调节细胞内MST1及FoxO1的活性表达。3.脂毒背景下,GPR119通过MST1-FoxO1通路参与调节胰腺β细胞损伤修复。