团头鲂Dmrt家族基因的克隆及其在早期发育和性腺发育中的表达

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团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国大宗淡水鱼类之一。近年来,随着集约化养殖规模的不断扩大,团头鲂的产量不断升高,但在增产的同时出现了很多亟待解决的问题,如性早熟、畸形、免疫机能下降等。果蝇的性别决定基因Doublesex与线虫的性别决定基因Mab3具有一个高度同源的区域,称为DM(Doublesex and Mab3)结构域。进一步的研究发现,在哺乳类、鸟类、爬行类以及鱼类等脊椎动物中也存在具有DM结构域的基因,统称为Dmrt(Doublesex and Mab3 Related Transcription Factor)基因家族。Dmrt是一类编码与性别决定相关的转录因子,被认为是脊椎动物中最原始的性别决定相关基因,尤其是Dmrt1基因,其他Dmrt基因除在性腺发育过程起到重要作用外,在非性腺组织的发育中也发挥一定的功能。本文通过RACE PCR及基因预测的方法得到了团头鲂5个Dmrt基因的cDNA全长序列,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对这几个基因在早期发育、不同组织及性腺各分期样品的表达量进行检测,预测各基因的功能。主要研究结果如下:  1.团头鲂Dmrt1基因有5个外显子,且存在选择性剪接现象,在团头鲂中至少存在4种剪接体,根据其缺失位置的先后顺序,依次命名为Dmrt1b、Dmrt1c、Dmrt1d,无缺失的为Dmrt1a。Dmrt1a cDNA全长2059 bp,编码266个氨基酸;Dmrt1b缺失第1个外显子,cDNA全长1861 bp,编码206个氨基酸;Dmrt1c缺失第2个外显子,cDNA全长1881 bp,编码139个氨基酸;Dmrt1d缺失第4个外显子,cDNA全长1914 bp,编码188个氨基酸。不同组织的半定量RT-PCR实验结果显示,Dmrt1基因仅在精巢中有表达,且主要是Dmrt1a和Dmrt1b基因。Dmrt1基因在6 hpf(原肠胚期)的表达量较高,且在出膜后的表达呈上升趋势,同时该基因主要在精巢中的表达量明显高于卵巢,在 V期时达到最大值,表明该基因可能对原始性腺的形成及性腺分化和发育起到一定的作用。  2.团头鲂Dmrt2a基因有4个外显子,cDNA全长2034 bp,编码510个氨基酸;Dmrt2b基因有3个外显子,cDNA全长1281 bp,编码328个氨基酸。Dmrt2a的表达量在11 hpf(体节出现期)时最高,在6 hpf时的表达量最低;Dmrt2b的表达量从受精后11 hpf开始增加,并在32 hpf(出膜期)达到最大值,出膜后,其表达量又下降到较低的水平。Dmrt2a和Dmrt2b基因在鳃中的表达量均较高,且在雌雄性腺中均有表达,表明这两个基因在团头鲂性腺组织和非性腺组织可能均发挥作用。Dmrt2a和Dmrt2b同源性较高,结构上高度保守及表达上部分相似,依据已有的研究可以推测,两者在功能上有重叠,但不能互补。  3.Dmrt3和Dmrt4基因有特殊的DMA结构域,有此结构域的基因在神经系统发育过程中起到一定的作用。团头鲂Dmrt3基因有2个外显子,cDNA全长1991 bp,编码449个氨基酸;Dmrt4基因有2个外显子,且5端存在选择性剪接现象,在团头鲂中发现有2种剪接体,Dmrt4a的cDNA全长1265 bp,编码352个氨基酸;Dmrt4b缺失了第1个外显子的部分序列,cDNA全长1081 bp,编码281个氨基酸。Dmrt3基因在6 hpf的表达量最高,而Dmrt4基因在32 hpf时的表达量最高,出膜后,前者的表达呈上升的趋势,后者的表达呈先降低后升高的趋势。Dmrt3和Dmrt4基因在鳃中均高表达,在肌肉和脑也有一定水平的表达,且在雌雄性腺中均表达,Dmrt3在精巢中的表达量显著高于卵巢,且在V期时达到最高水平,但Dmrt4在卵巢中的表达量显著高于精巢,且在II期时达到最高水平。  4.团头鲂5个Dmrt基因编码氨基酸的结构域序列与其他物种的相似性较高,而其他序列的相似性较低。团头鲂Dmrt1-Dmrt3-Dmrt2a3个基因存在同线性关系,且转录方向相同。团头鲂5个Dmrt基因的表达各有特点,但也存在相同点,如除Dmrt1基因外的4个团头鲂Dmrt基因在鳃中的表达量均较高,且均表现出雌雄性腺均表达的现象。
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