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研究背景 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）即存在于细胞壁外膜中的内毒素（endotoxin）成分，在革兰阴性菌感染的致病机理中起着十分重要的作用，亦是内毒素中毒休克发生的主要病因。对LPS介导的毒性反应一直是研究的热点，自80年代发现人类Toll样受体后，对LPS引起机体损伤的机制逐渐明朗化。最近的研究表明，LPS引起的免疫反应与Toll样受体有很大的关系，由TLR2和TLR4作为LPS信号转导受体，通过MyD88蛋白与IL-IR信号转导途径重合，最终导致NF-κB的激活，引起各种炎症因子基因表达。从C3H/HeJ小鼠获得的TLR4含有一个单氨基酸突变，导致对LPS的低反应性；而从TLR2缺陷小鼠分离出的巨噬细胞和B细胞对LPS反应的程度几乎与从野生型小鼠分离出的相同；中国仓鼠细胞（CHO）虽然对LPS有完全反应性，但它的基因组型编码的是TLR2的无功能基因；U973细胞虽然缺乏TLR2的表达，但也保留对LPS的反应性。所有这些研究都证明TLR4是LPS诱导的免疫反应的信号转导受体。研究目的 本研究从原代培养的人脐静脉内皮细胞中克隆TLR4的细胞外段基因，进行表达；并将TLR4基因导入不表达TLR4的HL60和人皮肤成纤维细胞，观察LPS对这两种转染细胞的反应。研究方法 1、以原代培养的人脐静脉内皮细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增TLR4细胞外 段基因，插入pMD18-T质粒，转化后，阳性克隆送全自动荧光测序。 2、将TLR4细胞外段基因克隆入pET-11a表达载体，获得重组表达的TLR4胞外 区蛋白。 3、将含TLR4全长基因的pCMVSPORT3质粒用Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，酶切产 物定向插入pcDNA3.1（+）质粒，转化后，阳性克隆提取质粒，以脂质体法 转染HL60和原代培养的人皮肤成纤维细胞，G418选择培养基筛选阳性细 胞。 4、将转染TLR4基因的细胞用LPS作用，观察TLR4对LPS反应的影响。研究结果 1、RT-PCR扩增出TLR4胞外区基因并克隆，送全自动荧光测序，与发表文献序 列一致。 中文摘要 一 2、将 TLR4胞外区基因克隆入 PET－118表达载体，重组表达 TLR4胞外区蛋白， 获得分子量为71kDa（SDS－PAGE）的预期蛋白。 3、将TLR4全长基因转染HL60和人皮肤成纤维细胞，获得稳定表达TLR4的 HL60细胞株。 4、TLR4可增强LPS对细胞的一定生长抑制作用，血清因子发挥协同增强作 用。 结论 成功从原代培养的人脐静脉内皮细胞中扩增出TLR4细胞外段基因，证实在LPS 反应中内皮细胞的信号转导途径可能与单核细胞、B细胞一样，是通过TLR介导 的。并将TLR4细胞外段克隆入pET叶 表达载体，获得71kDa的目的蛋白，为后续 研究TLR4胞外区功能打下基础。在稳定表达TLR4的HL60细胞株中，TLR4可增强 LPS对细胞的生长抑制作用，血清因子对TLR4的功能有协同作用。