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研究目的:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcohol fatty liver disease,NAFLD）已经成为一种普遍流行病。我们设计了实验验证NAFLD模型中细胞色素P450（cytochromeP450,CYP450）家族成员CYP2B6的m6A甲基化水平发生变化,并探讨了调控CYP2B6发生m6A甲基化修饰的调控机制,为NAFLD的发病以及治疗提供方向。研究方法:1.给小鼠喂食60%高脂饮食饲料（High fat diet,HFD）14周,建立小鼠高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病和胰岛素抵抗模型。2.小鼠肝脏组织进行免疫组化（immunohistochemistry,HE）染色,确定模型的脂肪变的发生。利用表观转录组基因芯片技术,绘制模型中差异基因的m6A甲基化修饰图谱。利用生信分析技术分析这些差异基因在脂肪肝形成中的潜在作用,以及预测这些基因潜在的调控通路。3.挑选出调控m6A甲基化变化相关性最高的一组基因,并利用基因芯片技术绘制该家族基因的m6A修饰变化图谱。4.MeRIP-qPCR实验,验证Cyp2b10 m6A甲基化水平在脂肪变的肝脏组织中升高。提取肝脏组织RNA进行qPCR实验,并制作石蜡切片,进行免疫组化实验,确定目的基因在脂肪肝中的表达水平。5.用油酸与棕榈酸2:1的混合液诱导人肝细胞LO2的脂肪变,通过油红染色和油红半定量实验确定诱导肝细胞脂肪变的最佳浓度。并结合MTT实验看不同浓度的脂肪酸对肝细胞的毒性作用的大小,以此筛出诱导的最佳浓度。6.游离脂肪酸诱导LO2脂肪变24小时,提取RNA,进行qPCR实验。并收取蛋白,进行Western Blotting（WB）实验,验证体外肝脂肪变模型中目的基因的表达变化。7.提取小鼠脂肪变肝脏的RNA和蛋白质,分别进行qPCR和Western Blot实验,筛选调控CYP2B6发生m6A甲基化的甲基化转移酶（Writers）,去甲基化酶（Erasers）。8.网站生信分析预测CYP2B6发生甲基化修饰的全部位点。利用MeRIP-qPCR技术验证调控CYP2B6基因发生m6A甲基化修饰的位点。双荧光素酶报告基因实验进行验证。9.干扰或者过表达METTL3,提取蛋白质,检测CYP2B6随METTL3变化的表达水平变化,验证METTL3对CYP2B6基因的调控作用。10.脂肪变的LO2细胞中干扰METTL3的表达。对细胞进行油红O染色,比较各组之间的差别,以此验证METTL3诱导的CYP2B6基因的m6A甲基化修饰在脂肪肝的脂肪形成中的作用。11脂肪变的LO2细胞中干扰METTL3,测膜蛋白与胞浆蛋白中GLUT4的表达差异变化。12.脂肪变的LO2细胞中干扰METTL3,Western Blotting实验,验证胰岛素信号通路的因子的表达变化。13.进行补救实验,METTL3干扰表达的基础上进行CYP2B6的过表达,验证胰岛素信号通路的因子的表达水平,探究CYP2B6过表达以后对METTL3调控的m6A甲基化修饰的逆转作用是否对脂肪肝患者的胰岛素抵抗有影响。14.脂肪变的LO2细胞过表达CYP2B6,Western Blotting实验,验证胰岛素信号通路的因子的表达水平。研究结果:1.HFD组小鼠体重较对照组增加明显,肝脏出现了明显的脂滴,且出现了胰岛素抵抗的病理状态,模型构建成功。HFD组出现了差异基因的m6A甲基化修饰表达谱的变化。GO/pathway分析,差异基因显著富集到代谢通路和二型糖尿病胰岛素抵抗信号通路中。2.在小鼠体内与人类CYP2B6基因同源的Cyp2b10发生了 m6A甲基化水平的升高,且Cyp2b10（CYP2B6）出现了差异性的过表达。3.体外实验中,用1mM的PA:OA混合液诱导效果最好。脂肪变的LO2细胞中CYP2B6表达水平升高。与小鼠模型实验结果一致。4.甲基化酶METTL3发生了明显的差异高表达,且变化有统计学意义。METTL3作为甲基化转移酶直接调控CYP2B6发生m6A甲基化的变化。且关于m6A甲基化修饰位点的MeRIP-qPCR的结果显示调控CYP2B6发生m6A甲基化的位点位于第66位和第1291位点。5.METTL3调控的CYP2B6的m6A甲基化变化在非酒精性脂肪性肝病中的脂肪形成中的作用不明显,而是通过调控胰岛素信号通路的分子如胰岛素受体底物（Insulin receptor substrates,IRS）,磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）,丝/苏氨酸激酶（AKT）,葡萄糖转运蛋白4（glucose transporters,GLUT4）来抑制胰岛素的敏感性。研究结论:METTL3调控的CYP2B6的m6A 甲基化修饰通过调控IRS/PI3K/AKT/GLUT4信号通路进而导致NAFLD患者的胰岛素抵抗。