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第一部分酸敏感离子通道在SH-SY5Y细胞的表达及功能目的：酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)自1980年在神经元细胞膜上首次被发现报道后,受到越来越多的关注。ASICs是一类胞外酸化激活的非电压门控的阳离子通道,不仅广泛表达于中枢神经系统,在外周神经系统以及非神经组织,如骨组织、味蕾、心血管等也有表达。不同的ASIC亚单位在多种生理病理过程中发挥着重要作用,包括缺血性脑损伤、疼痛、学习记忆、癫痫、多发性硬化、偏头痛、肠应激综合症等。人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞是一种多巴胺能神经细胞系,被广泛用作帕金森病细胞模型。尽管ASICs与多巴胺能神经元有一定关联,但SH-SY5Y细胞上是否有ASICs的表达目前尚无报道。本实验旨在从基因水平和蛋白水平检测ASICs的表达,并研究该通道在SH-SY5Y细胞上的特性。方法：采用逆转录PCR的方法在mRNA水平检测SH-SY5Y细胞ASICs的表达；实时定量PCR进一步定量分析ASIC1、2、3三种亚型在SH-SY5Y细胞的表达；western blotting方法在蛋白水平检测ASICs的表达；细胞免疫荧光标记的方法确定ASICs三种亚型在SH-SY5Y细胞上的分布；全细胞膜片钳检测SH-SY5Y细胞上ASICs电流特性；钙离子成像的方法检测SH-SY5Y细胞上ASICs通道的离子通透性。结果：(1)从基因和蛋白水平分别证实,ASIC1、2.3三种亚型在SH-SY5Y细胞上均有表达,实时定量PCR结果表明,ASIC1表达量最多,ASIC2和ASIC3较少。其中,ASIC1和ASIC3在胞膜、胞浆中均有分布,而ASIC2a主要分布在胞核。(2) SH-SY5Y细胞胞外pH值快速降低可诱发ASIC样电流,该电流可被100μM阿米洛利阻断；该电流具有pH依赖性,pH-0.5-为6.01±0.04；胞外酸化可引起胞内钙升高,该作用可被100μM阿米洛利和10nM PcTx1抑制。结论：SH-SY5Y细胞上存在ASICs功能性的表达,其中ASIC1表达量最多。第二部分酸敏感离子通道介导胞外酸化诱导的囊泡释放及其机制目的：神经递质释放时,突触间隙pH值会明显下降,ASICs作为胞外pH感受器,参与突触传递和学习记忆。已有报道ASICs在纹状体神经元上有表达,且ASICla是中间棘状神经元上的主要亚型。但ASICs在多巴胺能神经通路中的作用尚不明确。本实验旨在利用多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞,研究ASICs在胞外酸化引起的囊泡释放中的作用。方法：采用亲脂性苯乙烯基荧光染料FM1-43标记的方法观察SH-SY5Y细胞囊泡释放；钙离子成像技术探讨N型钙通道在胞外酸化引起的胞内钙离子浓度升高中的作用；电流钳记录酸刺激后SH-SY5Y细胞膜电位的变化。结果：(1)以高钾刺激作为阳性对照,pH6.0外液可明显增加SH-SY5Y细胞囊泡释放,该作用可被ASICs通道阻断剂阿米洛利及PcTxl抑制。(2)无钙外液及胞内钙耗竭剂CPA减少酸引起的囊泡释放增加。(3)N型钙通道阻断剂可减少酸引起的囊泡释放增加,而L型和P/Q型钙通道阻断剂对酸引起的囊泡释放增加无影响。(4)酸引起的胞内钙升高可被N型钙通道阻断剂抑制。(5)胞外酸化可引起SH-SY5Y细胞膜去极化。结论：酸激活ASICs引起钙内流,同时ASICs激活后引起胞膜去极化而激活N型钙通道,继而出现进一步的钙内流,最终胞内钙升高引起囊泡释放增加。