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坦布苏病毒(Tembusu Virus,TMUV)是一种新型黄病毒,于2010年在我国首次爆发。其传播迅速,可感染蛋鸭、种鸭和鹅等多种水禽,发病禽场的感染率常高达100%。目前,TMUV感染已成为危害我国水禽养殖业的主要疾病之一。外泌体是一种由细胞产生的膜性囊泡,在机体多种生理病理过程中发挥着物质运输和信息传递的作用。某些病毒感染细胞源外泌体中包含病毒核酸及蛋白等成分,能介导细胞感染,协助病毒进行免疫逃逸,在病毒感染过程中发挥重要作用。而目前对TMUV感染细胞源外泌体特性尚不清楚。本研究对TMUV感染细胞源外泌体的提取方案进行了优化,具体从细胞选取、维持时间确立和提取方法确立三个方面展开。研究对比了三种TMUV研究常用的细胞:HEK293细胞、C6/36细胞和DEF细胞接毒后的外泌体生成量,BCA蛋白浓度测定结果显示,HEK293细胞上清中提取的外泌体蛋白浓度最高,因此选用HEK293细胞作为外泌体制备用细胞。对细胞接毒后维持36 h和48 h的上清中外泌体进行比较,BCA蛋白浓度测定结果显示,维持48 h的细胞上清中外泌体的蛋白含量仅略高于维持36 h的细胞上清中外泌体蛋白含量,因此选取36 h作为接毒后的维持时间(在差异不显著情况下,宜选用较短维持时间以避免细胞状态下降带来的影响)。本研究还对超速离心法、试剂盒法和超滤离心结合试剂盒法的提取效率进行对比,结果显示,超速离心法和试剂盒法提取的外泌体蛋白浓度均在1μg/μL左右;而超滤与试剂盒法相结合的方法提取到样品浓度在12μg/μL左右,与前两者相比差异显著,Western Blot结果同样支持上述结论。以上试验结果表明,本研究优化了TMUV感染细胞源外泌体的提取方案,建立了一种以TMUV感染HEK293细胞并使用超滤结合试剂盒法对维持36 h的细胞上清中外泌体进行提取的方案。本研究用抗CD63抗体标记的免疫磁珠对外泌体进行纯化,并对纯化外泌体进行Western Blot分析、流式细胞仪分析和透射电镜拍摄。结果显示,外泌体表面标志物CD63、CD9和CD81均为阳性且含量较高,其中CD63和CD81的阳性率在56.5%~84.2%之间,且TMUV感染细胞源外泌体中含有TMUV E蛋白成分;透射电镜下观察到该外泌体形态完整,大小在20~200 nm之间,呈经典的茶托样结构,且无病毒粒子等杂质。以上试验结果表明,采用本研究中优化方案制备的外泌体数量较多,纯度较好,可用于后续研究。根据TMUV SDMS株的全基因组序列分段设计了12对特异性引物,对该外泌体cDNA进行扩增,结果显示,TMUV感染细胞源外泌体中含有全部的TMUV基因组成分,且与本研究使用的TMUV SDMS株序列同源性较高,变异性较小。将TMUV感染细胞源外泌体接种C6/36细胞,能导致细胞产生明显病变。IFA试验结果和qPCR病毒载量测定试验结果也显示该外泌体具有与病毒相类似的感染效果。本研究制备了高免血清,对外泌体和TMUV进行中和试验和细胞感染试验。IFA试验结果显示,经过中和的TMUV对C6/36细胞的感染能力大幅下降,在激发光下只表现微弱荧光;而经过中和的外泌体感染效果却仅次于受中和前的外泌体和病毒的感染效果。以上试验结果表明,TMUV感染细胞源外泌体能介导C6/36细胞感染,并能有效躲避抗体中和效应,协助病毒进行免疫逃逸。