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某些天然代谢产物的原始产生菌由于不可培养、遗传操作难、生长缓慢、抗生素产量低等特点,通常采用异源表达基因簇的策略对它们的生物合成途径进行研究。异源表达技术通常应用于天然代谢产物生物合成基因簇的克隆、相关基因功能的鉴定以及代谢调控等研究中。基因簇异源表达通常需要一个优良的异源表达宿主。链霉菌因其编码多种次级代谢合成基因簇,合成结构多样化的代谢中间体,为各种类型天然代谢产物生物合成提供丰富的前体,以及兼容性好的特点,通常被作为异源表达宿主的首选。本研究选择链霉菌FR-008作为异源表达宿主的出发菌株是因为:链霉菌FR-008生长迅速,3天即可产生成熟的孢子;遗传操作简单;发酵培养基要求低;具有很好的代谢潜能:能产生10 g/L的杀念菌素;全基因组已完成测序,为分子遗传实验奠定了理论基础。FR-008有两个线性质粒（142 kb的pHZ227,其编码了砷抗性基因簇;24 kp的pHZ228）,本研究利用亚硝基胍（NTG）诱变消除大线性质粒的方法来简化FR-008的基因组。从103个诱变株中筛选到3株砷敏感的突变株（10#、59#、115#）,脉冲场凝胶电泳检测发现它们均丢失了大线性质粒pHZ227。此外,得到了被消除小线性质粒pHZ228的42#突变株,在此突变株基础上,进行了第二轮NTG诱变,获得了双质粒消除的突变株XYS1。大小线性质粒的消除率分别为3%和1%。HPLC检测发酵液的结果显示:两个大线性质粒消除突变株（10#和115#）杀念菌素有效组分III的产量相对野生型链霉菌FR-008分别提高了40%和30%。为了探究大线性质粒的消除与杀念菌素产量的提升之间是否存在关联,我们利用CRISPR/Cas9-CodA（sm）系统敲除了大线性质粒。发酵结果显示:大线性质粒的消除对杀念菌素的产量并无影响,因此突变株10#和115#杀念菌素产量的提升可能是因为亚硝基胍引起了染色体DNA的突变造成的。在115#和10#的基础上,本研究采取以下策略对它们进一步遗传改造。首先构建了一个多功能敲除质粒pXYS5,通过同源双交换,将特异性整合位点attB和T7 polymerase替换了控制FR-008菌丝体聚集的基因（matAB;ORF06931）,获得了突变株115#1和10#1。敲除了ORF06931的突变株115#1和10#1的菌丝体在液体培养基中不再聚集,呈分散状态;且生物量较出发菌株提高了约40%,发酵结果显示,相比于115#和10#,115#1和10#1杀念菌素的产量分别提高了46%和18%;其中115#1的杀念菌素产量为所有突变株中最高的。另外,attB的引入提升了整合型质粒接合转移的效率;T7 polymerase的引入使得受T7启动子调控的基因在突变株中可以正常表达。因此获得来源于链霉菌FR-008,具备多重优良性状的菌株115#1。最后,本研究选取了杀念菌素产量最高的突变株115#1作为异源表达宿主,研究不同类型天然代谢产物在该宿主中异源表达情况。通过接合转移将包含核苷类抗生素米多霉素生物合成基因簇的粘粒14A6转入到115#1,米多霉素异源表达菌株115#1::14A6的发酵液经HPLC和MS检测,其中含有目标产物米多霉素。HPLC检测比较在菌株115#1和S.lividans 1326中的米多霉素的产量,结果显示:115#1::14A6发酵液中米多霉素的产量为3770 mg/L,比野生型龟裂链轮丝菌ZJU5119米多霉素的产量（1015 mg/L）还要高;而S.lividans 1326::14A6发酵液中米多霉素的产量不足10 mg/L,这表明相比较S.lividans 1326,115#1作为米多霉素的异源表达宿主具有明显优势。同时,通过接合转移将氨基糖苷类抗生素链丝菌素生物合成基因簇的质粒8E6转入到115#1,链丝菌素异源表达菌株115#1::8E6的生物活性检测结果显示,115#1::8E6能够产生抑制金黄色葡萄球菌的活性物质（链丝菌素）。通过生物活性检测实验对比了分别在115#1与S.ceolicolor M1154中的异源表达链丝菌素的量（抑菌圈的大小）,链丝菌素在115#1中的异源表达量稍微高于S.ceolicolor M1154中的异源表达量。总之,我们通过亚硝基胍消除了链霉菌FR-008的线性质粒,获得了两株基因组简化的杀念菌素高产菌株10#和115#突变株,进一步通过敲除控制菌丝体聚集的基因OFR06931使得菌丝体分散,获得了同时增加生物量和杀念菌素产量的突变株10#1和115#1。选取了杀念菌素产量最高的115#1作为异源表达宿主,成功实现了米多霉素和链丝菌素在115#1中的异源表达。其中米多霉素在115#1中的产量是野生型龟裂链轮丝菌ZJU5119的3.5倍,是米多霉素异源表达菌株S.lividans1326::14A6的500倍,充分显示了115#1作为核苷类抗生素异源表达宿主的优越性。因此我们将链霉菌FR-008成功改造为一个有效的异源表达宿主。