中华鳖“摇头病”病原的分离鉴定及其对中华鳖4个免疫相关基因的影响研究

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中华鳖“摇头症”的爆发,使得鳖大规模死亡,给中华鳖养殖业造成严重经济损失。为确定病原,了解病原致病情况和对机体的损伤情况,进而提出合理的防治办法,本研究首次从中华鳖国家水产新品种清溪乌鳖病鳖中分离获得到一株病原菌,通过综合形态观察、革兰氏染色、16S rDNA、gyr B和rpo B序列测定比对及菌生理生化指标测定等对病原菌鉴定,并进行药敏试验;接着运用PCR方法分析其毒力基因,并通过内脏组织切片来观察其对组织的侵袭情况;通过转录组测序分析该菌对中华鳖转录组产生的影响;最后通过荧光定量PCR法测定机体各组织的免疫基因MyD88、TLR2、TLR3、TLR4表达水平。研究结果如下:1.病原菌的分离鉴定及药敏试验(1)分离获得的该病原菌呈乳白色融蜡状凸起,革兰氏染色阳性且具有芽孢,呈单个或链状排列;生理生化指标与《常见细菌系统鉴定手册》蜡样芽孢杆菌描述基本一致,16S rDNA基因、gyr B基因和rpoB基因序列分析以及系统进化树结果显示,该菌株为蜡样芽孢杆菌群(Bacillus cereus group)内新种,命名为蜡样芽孢杆菌XS0724菌株。人工注射感染可复现发病症状,表现为浮于水面、反应迟钝、四肢无力、不断摇头而死亡。经测定其LD50为2.42×105 CFU/kg体重。(2)药敏试验发现,此株菌对头孢氨苄、氟苯尼考、强力霉素、恩诺沙星、氧氟沙星高度敏感,对麦迪霉素、呋喃妥因、妥布霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、庆大霉素、万古霉素中度敏感,对利福平、头孢他啶耐药。2.病原菌的毒力基因及其对组织的侵袭情况(1)对蜡样芽胞杆菌10个常见毒力基因的PCR检测发现,蜡样芽孢杆菌XS0724菌株包含非溶血性肠毒素基因(nheA、nheB、nheC)、溶血性肠毒素基因(hblA、hblC和hblD)和肠毒素基因(entFM)等7个毒力基因,表明本株蜡样芽孢杆菌为有毒菌株,且具有较高毒性。(2)组织病理切片显示,中华鳖的肝脏、脾脏、肠道受损较为严重,肾脏和肺部相较于上述三个部位情况较轻,但也有病变可见;同时在肝脏和脾脏中可见大量病原菌聚集。3.病原菌感染的中华鳖脾脏转录组的影响转录组分析最终得到Clean Data约42.63 Gb,各样品的数据量均在6.07 Gb以上,数据拼接后共获得348,665条Unigene。差异表达基因统计发现,注射菌XS0724的实验组(Case)相比于注射PBS的对照组(Control)共18593个差异表达基因,其中上调基因9678个,下调基因8915个。KEGG通路富集主要集中在toll样受体信号通路、抗原处理及呈递通路、IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、自身免疫缺陷、寄生虫病、结核、人类肿瘤和金黄色葡萄球菌感染等免疫相关通路。4.病原菌感染的中华鳖各组织4个免疫基因表达情况除脑部外其他所测定组织中MyD88 mRNA表达均与对照组存在极显著差异(P<0.01),相对表达水平顺序依次为脾脏>肌肉>心脏>肾脏>肺>血液>肝脏>肠>脑。TLR2 mRNA表达量相对于对照组,除肠和血液两者无显著差异外(P>0.05),在脑中有显著差异(P<0.05),其余组织均有极显著差异(P<0.01),相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>心脏>血液>肺>肾脏>肝脏>脑>肠。TLR3 mRNA表达量相对于对照组在肺部有显著差异(P<0.05),其余组织中有极显著差异(P<0.01),相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>血液>心脏>肝脏>肺>肾脏>肠>脑。TLR4mRNA表达量相对于与对照组在肠中无差异(P>0.05),肺及血液相有显著差异(P<0.05),其余各组织均有极显著差异(P<0.01),相对表达水平顺序依次为肌肉>脾脏>心脏>肾脏>肝脏>肺>血液>脑>肠。综上所述,蜡样芽孢杆菌XS0724菌株对中华鳖具有致病性,在选择蜡样芽胞杆菌作为益生菌使用时应加以区别;该有毒菌株毒性大,对中华鳖肝脏、脾脏、肠道破坏性强,在治疗和预防过程中可优先考虑有益于肝脏、脾脏、肠道的药物;头孢氨苄、氟苯尼考和强力霉素等可用于疾病治疗。
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