本文利用PCR、5’和3’RACE技术克隆了猪Ca2+离子通道蛋白基因家族(Catsper1、Catsper2、Catsper3、Catsper4)和透明带结合蛋白2(ZPBP2)基因,获得了其cDNA全序列;然后利用RT-PCR和半定量RT-PCR技术系统分析了若干精子功能基因家族在梅山公母猪生殖道和成熟精子中的时空表达特性,这些功能基因包括精子黏附蛋白基因家族(Spermadhesins,包括AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII)、富含半胱氨酸分泌蛋白基因家族(CRISP1、CRISP2、CRISP3)、II型纤维连接蛋白基因家族(ELSPBP1和pB1)、Ca2+离子通道蛋白基因家族(Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4)、透明带结合蛋白基因家族(ZPBP1和ZPBP2)和精子运动抑制因子基因(SPMI);并进一步分析了精子黏附蛋白基因家族(AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII)和精子运动抑制因子基因(SPMI)的在成熟精子中mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应的关联。主要研究结果如下:1.获得了猪Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4基因cDNA全序列及5’和3’非编码区,其中Catsper1基因mRNA长为2452bp,含2169bp开放阅读框及99bp 5′非编码区和184bp 3′非编码区;Catsper2基因mRNA长为2054bp,含1599bp开放阅读框及333bp 5′非编码区和122bp 3′非编码区;Catsper3基因mRNA长为1340bp,含1200bp开放阅读框及121bp 5′非编码区和19 bp 3′非编码区;Catsper4基因mRNA长为1799bp,含1350bp开放阅读框及47bp 5′非编码区和402bp 3′非编码区。不同物种氨基酸序列同源性分析表明,猪Catsper1与马(72%)、狗(78.7%)和牛(64%)的同源性较高,而与人(53.9%)、大鼠(47.5%)和小鼠(48.8%)的较低;猪Catsper2与人(78.1%)、马(88%)、狗(88.5%)、牛(87.8%)的同源性较高、与大鼠(25.2%)和小鼠(24.3%)的同源性较低;猪Catsper3与牛(84%)、狗(85.3%)和人(71.6%)的同源性较高,与大鼠(63.7%)和小鼠(64.1%)的同源性中等;与其它Catsper蛋白(Catsper1-3)相比,猪Catsper4与人(77.4%)、牛(81.4%)、狗(77.4%)、大鼠(71.7%)和小鼠(68.8%)的同源性均较高。不同物种序列比对表明Catsper1蛋白的氨基酸序列在C端相对保守,而在N端同源性低。Catsper2蛋白的氨基酸序列在C和N端相对保守,而在靠近C端的中间序列同源性低。Catsper3和4蛋白的氨基酸序列在N和C端保守性相对较低,而中间序列比较保守。结构域预测表明猪Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4蛋白中都存在6个跨膜区和1个超螺旋结构(coiled coil),其中Catsper1的6个跨膜区靠近C端,而Catsper2、Catsper3和Catsper4的6个跨膜区靠近N端,而4个蛋白的超螺旋结构都位于C端。2.Catsper1-4基因在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明,Catsper1-4基因主要在睾丸中表达,但Catsper1基因在整个附睾(头、体、尾),以及子宫颈和子宫角也有表达。此外Catsper3基因在前列腺中也有少量表达。而Catsper2和Catsper4是睾丸特异表达。Catsper1-4基因在梅山公猪睾丸组织中的发育性表达分析表明,整体上从初生至公猪性成熟阶段,Catsper1-4基因的表达水平是随着日龄的增加而升高的,但不同基因存在一些差异。其中Catsper1和Catsper4基因的表达都在初生时启动,但维持很低水平,30日龄时Catsper1基因表达水平略有上升,而Catsper4基因表达水平显著下降(P<0.05,与初生时相比)。随后Catsper1和Catsper4基因在60和90日龄时都呈现明显的上升(P<0.05),Catsper1上升直至150日龄(P<0.05),而Catsper4在150日龄时略有下降。60日龄时才检测到Catsper2和Catsper3基因的表达,但维持在较高水平,在90日龄时都呈现明显的上升(P<0.05),Catsper2基因的表达保持升高趋势至150日龄(P<0.05),而Catsper3基因的表达在150日龄时有显著下降(P<0.05)。3.获得了ZPBP2基因的两个拼接形式的mRNA序列(1488bp and 1269bp)。两个mRNA序列分别包括981bp和762bp的开放阅读框及131bp的5′非编码区和376bp 3′非编码区。981bp的开放阅读框编码326个氨基酸前体肽。而762bp的开放阅读框编码253个氨基酸前体肽。序列分析表明猪ZPBP2蛋白与人的同源性为82%,与大鼠的同源性为76%,与小鼠同源性为75%。哺乳动物ZPBP2序列比对表明其有一个保守的C末端,而N端包括信号肽在内保守性低。ZPBP2的15个半胱氨酸在成熟肽中高度保守,通过PredictProtein在线预测发现了一些保守的氨基酸基序。此外SMART程序还发现了一个类免疫球蛋白结构域,两个重叠的类表皮生长因子结构域,其中两个类表皮生长因子结构域位于羧基末端半胱氨酸富集区内。4.ZPBP1/2基因在150日龄公母猪生殖道组织中的RT-PCR分析结果表明:ZPBP1基因仅限于睾丸中高丰度表达,其它所有生殖道组织均无表达。而ZPBP2则在精囊腺、附睾尾和睾丸表达,但在睾丸中表达丰度最高。此外在精囊腺中检测到ZPBP2选择性拼接异构体2表达。ZPBP1/2基因发育性表达分析表明:在60日龄睾丸中可以检测到ZPBP1基因RT-PCR产物,至90日龄表达水平有显著升高(P<0.05),一直持续升高至150日龄(P<0.05)。而ZPBP2基因的表达在初生时即已经启动,但表达水平较低,至30日龄时有显著下降(P<0.05),但从30日龄到60日龄有显著提高,并持续直至150日龄(P<0.05)。在30日龄的精囊腺中检测到ZPBP2基因的表达,但一直至60日龄保持较低水平,至90时表达水平有显著升高(P<0.05),并保持持续升高到150日龄(P<0.05)。5.精子黏附蛋白基因家族(AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII)在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明:AWN、PSPI和PSPII三个基因在所有组织中都有表达。AQN1基因除在附睾体、输卵管和卵巢组织中没有表达,在其它生殖道组织中均有表达。AQN3基因除在附睾体、睾丸和卵巢中没有表达外,在其它生殖道组织中均有表达。该家族的所有基因在精囊腺中的表达强度最高,前列腺和附睾体中的表达强度中等,而在附睾体和睾丸中表达强度很弱或不表达,但AWN基因在睾丸组织中有较高的表达水平。精子黏附蛋白基因家族发育性表达分析表明:在精囊腺中AQN1, AQN3, PSPI和PSPII的相对表达量随日龄升高稳定增加,AWN的表达量在整个生长发育阶段相对稳定。AQN1和PSPI的表达从初生至30日龄有显著提高(P<0.05),然后PSPI保持缓慢的增加直到90日龄,至150日龄时有显著提高(P<0.05)。AQN3和PSPII在60、90和150日龄都有显著提高(P<0.05)。AQN1在60和150日龄有显著提高(P<0.05)。在前列腺中则呈现不同特点,AWN, PSPI和PSPII基因在仔猪出生后即有较高的表达,60日龄时表达水平达到高峰,60日龄至150日龄期间表达水平逐渐降低;而AQN1在出生至60日龄表达水平较低,60日龄至90日龄表达水平迅速升高(P<0.05),150日龄时逐渐达到表达高峰。AQN3在30和60日龄时表达有显著提高(P<0.05),然后开始下降直到150日龄。尿道球腺中,PSPII初生时表达水平很低,然后在30日龄时显著提高,在60、90和150日龄时分别有显著提高(P<0.05)。而AQN1、AQN3、AWN和PSPI四个基因在60日龄前都未能检测到表达,但AQN1、AQN3、AWN在90和150龄都有显著提高(P<0.05),而PSPI则在60、90和150日龄时维持在较高水平,但不同日龄间无显著差异。6.富含半胱氨酸分泌蛋白基因家族(CRISP1、CRISP2、CRISP3)和II型纤维连接蛋白基因家族(ELSPBP1和pB1)在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明,CRISP1在整个附睾(头、体和尾)都有较强的表达信号,而在精囊腺和前列腺中的表达信号中等。CRISP2基因在生殖道的表达更加广泛,其中在睾丸的表达丰度最高,附睾尾和输卵管的表达中等,在前列腺、尿道球腺,附睾体,子宫颈和输卵管的表达较弱,在精囊腺、子宫角和卵巢没有表达。CRISP3在前列腺和尿道球腺高水平表达,在睾丸和卵巢有少量表达。ELSPBP1基因在附睾尾高丰度表达,在附睾体表达水平中等,在精囊腺和前列腺中表达较弱。pB1基因在整个生殖器官有广泛的表达,在精囊腺、前列腺、附睾头、附睾体、睾丸和卵巢有高丰度的表达,并在尿道球腺、附睾尾及子宫颈有少量表达。CRISP和Fn-2基因在公猪生殖道组织的发育性表达分析表明,总体上,CRISP和Fn-2基因呈现了不同发育性表达特点。CRISP1和CRISP3的表达在初生时启动,且从出生到性成熟一直维持高水平表达。而CRISP2表达在60日龄时能检测,并保持较高水平到90日龄,150日龄时略有下降。ELSPBP1基因初生时表达水平较低,但在30日龄时显著提高(P<0.05),然后保持稳定直到150日龄。pB1基因在1日龄和30日龄为中等水平表达,在60日龄时显著提高(P<0.05),然后保持直到150日龄。7.SPMI基因在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明:SPMI基因在精囊腺中的表达丰度最高,其次是尿道球腺,再次是子宫角,在前列腺,子宫颈和卵巢中的表达较弱。发育性表达分析表明,SPMI基因在精囊腺和尿道球腺中的表达呈现相似的规律,SPMI基因在两个组织的表达都在初生时即启动,然后随着日龄的增加,表达水平不断提高,直到成年(150日龄)。其中SPMI基因在精囊腺中60日龄的表达较30日龄时有显著提高(P<0.05),而在90和150日龄的表达较前一日龄都有显著提高(P<0.05)。而SPMI基因在尿道球腺中30日龄的表达较初生时有显著提高(P<0.05),60日龄的表达较30日龄时有所提高,但差异不显著,而在90和150日龄的表达较前一日龄也都有显著提高(P<0.05)。8.相关精子功能基因家族在成熟精子中RT-PCR检测结果表明:三类主要精浆蛋白基因家族,除ELSPBP1外,在成熟精子都存在mRNA表达,但表达丰度存在差异,其中精子黏附蛋白家族所有成员AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII的表达丰度很高;而富含半胱氨酸分泌蛋白家族的CRISP2和II型纤维连接蛋白家族中的pB1也呈高丰度表达。CRISP1和CRISP3表达丰度较低;SPMI基因mRNA在成熟精子高丰度表达。但ZPBP1/2和Catsper1-4在成熟精子中没有检测到mRNA表达信号。9.精子黏附蛋白基因家族(AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII)和精子运动抑制因子基因(SPMI)的mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应的关联分析表明,在低活力精子中AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII和SPMI基因的mRNA的表达显著高于高活力精子;精子体外获能能够显著影响AQN1、AQN3、PSPI和PSPII的mRNA表达;精子体外诱导顶体反应能够显著影响AWN、PSPI和PSPII的mRNA表达。以上结果提示,总体而言,与以往相关研究相比,本研究中所检测的有些精子功能基因(Catsper1、Catsper3、ZPBP2、AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII、CRISP1、CRISP2、CRISP 3、ELSPBP1、pB1、SPMI)在梅山公母猪生殖道组织的空间表达呈现更加广泛的特性,这可能与梅山猪特殊的种质特性有关;除CRISP1和CRISP3外,本研究所涉及到的大多精子功能基因(Catsper1-4、ZPBP1/2、AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII、CRISP2、ELSPBP1、pB1、SPMI)发育性表达呈现日龄依赖性,其mRNA表达水平变化与性发育相一致,在梅山公初情期前后(60-90日龄)有显著提高,并在性成熟阶段(90-150日龄)维持较高水平。首次报道主要精浆蛋白基因家族和SPMI基因在成熟精子中的mRNA表达;精子黏附蛋白基因家族(AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII)和精子运动抑制因子(SPMI)在成熟精子中的mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应存在关联,有可能作为精液质量和受精率的标记。