论文部分内容阅读
基因突变是自然界普遍存在的现象,然而大多数情况下,基因突变往往会产生不利影响,会导致生物的各种疾病乃至死亡。因此,检测各种生物及医学样本中存在的基因突变有着非常重要的理论和现实意义,为此人们也已经建立了一系列的突变基因检测方法。然而,在很多情况下,样本中的突变基因丰度往往很低,突变型基因常常是与野生型基因共存,并且在很多情况下都是少量的突变型基因淹没在海量的野生型基因之中,这给相关突变基因的检出带来了极大的困难。而检测样本中的低丰度突变基因毫无疑问在诸如无创产前诊断、癌症早期诊断以及癌症个体化治疗等诸多领域均有着非常诱人的应用前景。2011年Makrigiorgos GM研究组发展出了一种称为ice-COLD-PCR的新型未知突变基因富集检测技术。该技术最大的特点是在PCR体系中引入一条与野生型模板完全匹配但长度略短的参考序列。该技术先通过高温变性和低温退火,使得过量的参考序列和模板双链中的一条形成互补双链,随后通过将PCR反应的退火温度设定在一个特定的关键变性温度下,该温度下体系中参考序列与野生型DNA之间形成的纯合互补双链仍然处于双链状态,而参考序列与突变型DNA之间形成的杂合互补双链则基本已经解开,从而实现对突变型DNA的优先扩增。由于可以对样本中的各种未知突变进行富集检测,富集效率较高且操作简单,能与各种下游检测技术之间实现无缝衔接,ice-COLD-PCR被认为是现有未知突变基因富集检测技术之典范。然而,该技术自身也仍然存在着一些不足,仍然有一些可以改进和提高的余地:首先,由于参考序列与模板序列形成互补双链的熔解温度低于模板双链的熔解温度且略高于关键变性温度,因此可能发生解链的单链突变型基因与未经封闭的另一条模板DNA重新形成互补双链,从而严重影响突变型基因的扩增效率。其次,单碱基错配所引起的DNA双链熔解温度下降仅为零点几度,使得这一技术在实际运用时对野生型和突变型基因扩增的差异程度比较有限,因而这一技术对PCR仪的温控系统要求极高。针对上述不足,在本研究中我们提出了将锁核酸(locked nucleic acid,LNA)技术与现有ice-COLD-PCR技术相整合的LNA-COLD-PCR技术。相对于天然寡核苷酸序列,LNA对DNA及RNA有着更强的亲和力,并且有着更强的识别碱基错配的能力。参照ice-COLD-PCR原始文献,本研究设计并合成了相关的LNA封闭序列、构建了一系列标准样品。通过对封闭序列浓度、关键变性温度以及模板浓度等多个相关参数进行系统的优化,本研究初步建立了LNA-COLD-PCR技术平台。通过引入LNA作为封闭序列,LNA-COLD-PCR成功的实现了Tml(模板双链)<Tc<Tmm2(封闭序列与野生型结合),从而解决了上述提到的第一个问题。此外,由于LNA有着更强的识别碱基错配的能力,在一定程度上也解决了单碱基错配所引起△Tm值不够大的问题。上述两个问题的解决使得我们初步建立了性能更为优越的新型未知突变富集技术LNA-COLD-PCR技术。采用LNA作为封闭序列,使得LNA-COLD-PCR可以更大程度的实现差异扩增,对PCR仪温控的要求也随之降低。即使在普通PCR仪上运行,配合普通Sanger测序,LNA-COLD-PCR也可以清晰检出样本中含有的低至3%的不同类型的未知突变基因,显著优于现有COLD-PCR、ice-COLD-PCR等技术。