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动物乳腺生物反应器是指利用动物乳腺特异性乳蛋白基因的调控序列构建表达载体,来生产转基因动物,指导外源基因在乳腺中特异性高效表达,并能从乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。而体细胞基因打靶—核移植技术由于能够将外源基因定点整合到受体细胞基因组中,克服随机整合带来的位置效应及多拷贝插入问题,实现外源基因在动物乳腺中特异性高效表达等优势,目前已成为制备动物乳腺生物反应器的主要技术选择。本研究就是利用基因打靶技术将人白血病抑制因子(hLIF)基因定位整合至奶山羊β-酪蛋白基因座,并验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达,以期为获得能特异性高效表达hLIF基因的乳腺生物反应器打下基础。合成一段两端带有同向LoxP序列的多克隆位点序列,并将其插入到骨架载体pBluescript_SK+中,得到载体pLoxP。然后将克隆得到的山羊β-酪蛋白5′和3′端同源臂,正向筛选标记基因neo和负向筛选标记基因tk插入到载体pLoxP中,得到山羊β-酪蛋白基因座通用打靶载体pLoxP-NT53。再将hLIF基因克隆到载体pLoxP-NT53中从而得到hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。其中hLIF基因位于山羊β-酪蛋白基因第七外显子下游,neo基因位于两段同向LoxP序列之间,tk基因位于山羊β-酪蛋白3′同源臂外侧。采取泌乳期奶山羊乳腺组织,利用组织块贴壁培养法培养原代奶山羊乳腺上皮细胞。经细胞传代纯化后,将经SwaⅠ酶切线性化后的重组质粒pLoxP-NT53L通过脂质体转染整合至奶山羊乳腺上皮细胞基因组中,利用G418和CANC对转染细胞进行双重抗性筛选,并对获得的抗性细胞克隆进行PCR、实时定量PCR和Western blotting检测,以验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达情况。酶切和测序分析结果显示,本试验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。对经筛选获得的抗性细胞克隆进行hLIF基因PCR和实时定量PCR检测,得到14个阳性细胞克隆。将阳性细胞克隆进行激素诱导后利用山羊β-酪蛋白基因启动子指导hLIF表达,进行Western blotting检测,结果有2个阳性克隆成功表达了hLIF蛋白。表明hLIF基因已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。从而为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。