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背景:新型冠状病毒肺炎（Corona virus disease 2019,COVID-19）的大流行对国家公共卫生安全及全球经济造成巨大冲击。截至2022年3月12日,全球COVID-19确诊病例超过4.5亿例,死亡病例超过602万例。与此同时,新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）在动物中的感染形势也日益严峻。截至2022年1月31日,世界动物卫生组织（World organization for animal health,OIE）通报了35个国家和地区共计645起水貂、猫、仓鼠、白尾鹿、狮子、大猩猩等19种动物的SARS-CoV-2感染事件。其中,在水貂动物群体中出现了SARS-CoV-2水貂变异株。研究表明,SARS-CoV-2水貂变异株可由水貂向人类传播。因此,荷兰、丹麦等国家扑杀了数百万只水貂。目前国内外对于动物SARS-CoV-2感染的关注日益密切,相应的兽用疫苗研究及接种计划也在有序推进。这一形势下,研发兽用COVID-19疫苗对于保护SARS-CoV-2易感的伴侣动物、毛皮动物、家畜及珍稀野生动物,降低SARS-CoV-2由动物向人传播的风险具有重要意义。目的:水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）作为病毒疫苗载体具有生长滴度高、免疫原性好、不受抗载体免疫的影响等优点。本研究拟利用VSV载体构建一种复制增殖型SARS-CoV-2重组VSV疫苗,并在BALB/c小鼠和金黄地鼠中进行免疫原性评价,对滴鼻（Intranasal injection,i.n.）和肌肉注射（Intramuscular injection,i.m.）两种免疫途径所诱导的免疫应答和保护效果进行比较。本研究旨在开发一种安全、有效、便捷的兽用COVID-19候选疫苗。方法:1.SARS-CoV-2重组VSV载体疫苗的构建与鉴定将SARS-CoV-2水貂变异株cluster 5的刺突蛋白S基因功能性开放阅读框（Open reading frames,ORFs）克隆至VSV全长骨架基因组中,替换VSV的糖蛋白G基因,得到两个SARS-CoV-2重组VSV感染性克隆全长质粒p3.1-VSVΔG-S及p3.1-VSVΔG-S-e GFP。将全长质粒及辅助质粒p3.1-VSV-N、p3.1-VSV-P、p3.1-VSV-L及p3.1-VSV-G共转染BSR-T7细胞以拯救重组病毒r VSVΔG-S及携带e GFP标签的重组病毒r VSVΔG-S-e GFP。随后传代并通过RT-PCR、间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IF）、蛋白质免疫印迹（Western bolt,WB）、透射电镜观察、生长动力学等方法鉴定上述拯救的重组病毒。2.SARS-CoV-2重组VSV载体疫苗的小鼠免疫试验以10~6TCID50/只剂量的r VSVΔG-S免疫BALB/c小鼠,设置i.m.免疫组及i.n.免疫组,采用0、21天两针剂的免疫方案。免疫后第14、28及42天（Day post vaccination,dpv）采血,进行SARS-CoV-2特异性结合抗体、抗体亚型及中和抗体（Neutralizing antibody,n Abs）检测;35 dpv收集肺泡灌洗液进行SARS-CoV-2特异性分泌型Ig A（Secretory Ig A,SIg A）检测;28 dpv利用ELISpot检测脾细胞IL-4及IFN-γ活化水平并利用流式细胞术检测CD3+CD4+及CD3+CD8+双阳性T细胞比例。3.SARS-CoV-2重组VSV载体疫苗的金黄地鼠免疫与攻毒保护试验用重组病毒载体疫苗r VSVΔG-S免疫金黄地鼠,免疫方案同小鼠。于14、28 dpv采血进行SARS-CoV-2 n Abs及特异性结合抗体检测。35 dpv以10~5TCID50SARS-CoV-2/只动物的剂量攻毒,攻毒后一周内连续记录动物的临床特征。攻毒后第3天（Days post infection,dpi）取鼻甲及肺组织进行病毒RNA拷贝数及TCID50测定,同时对肺组织进行肺部病理切片苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）染色及免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）分析。结果:1.重组病毒载体疫苗的鉴定结果显示,病毒基因组经SARS-CoV-2 S特异性引物扩增后在3816 bp处出现特异性条带,经测序比对结果正确;IF及WB鉴定结果表明,重组病毒在感染Vero E6细胞后可被SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体识别,目的蛋白条带约为180 k Da。经透射电镜观察发现重组病毒表面纤突呈典型的冠状,间接表明S蛋白成功装配到重组病毒粒子表面;生长动力学曲线显示r VSVΔG-S和r VSVΔG-S-e GFP具有相似的生长动力学特征,均可在72 h达到最高生长滴度106.8TCID50/m L。以上结果表明,成功拯救出重组病毒r VSVΔG-S和r VSVΔG-S-e GFP。2.小鼠免疫试验结果显示,r VSVΔG-S经i.m.免疫,56 dpv时n Abs几何平均滴度（Geometric mean titer,GMT）为143,42 dpv时特异性Ig G GMT为25267,Ig G2a/Ig G1＜1,脾淋巴细胞IL-4及IFN-γ分泌显著升高;r VSVΔG-S经i.n.免疫,56 dpv时n Abs GMT为13,42 dpv时特异性Ig G GMT为3158,Ig G2a/Ig G1＞1,肺泡SIg A效价在1:64～1:512之间,脾淋巴细胞IFN-γ分泌显著升高。研究结果表明:重组病毒载体疫苗在小鼠中经i.m.免疫可诱导更高水平的n Abs及特异性Ig G抗体;重组病毒载体疫苗经i.n.免疫可诱导SIg A为主的粘膜免疫应答及以Th1型细胞免疫应答。3.金黄地鼠免疫及攻毒保护结果显示:r VSVΔG-S经i.m.免疫n Abs及特异性抗体水平相对较低,攻毒后病毒载量及RNA拷贝数与对照组相比有所降低,但不能完全清除病毒,肺组织出现了中度的损伤,有较多SARS-CoV-2抗原残留;r VSVΔG-S经i.n.免疫28 dpv时n Abs GMT为1878,特异性Ig G GMT为96647,攻毒后肺及鼻甲病毒RNA拷贝数显著降低,感染性病毒滴度降至检测线以下,肺组织得到良好的保护。研究结果表明:在金黄地鼠中,i.n.免疫组的体液免疫应答水平及攻毒保护效果均优于i.m.免疫组。结论:1.成功构建复制增殖型SARS-CoV-2重组VSV载体疫苗r VSVΔG-S和重组病毒r VSVΔG-S-e GFP。2.在小鼠免疫试验中,r VSVΔG-S经i.m.免疫诱导了强烈的体液免疫应答,中和抗体及特异性抗体水平显著高于i.n.免疫组。3.在金黄地鼠免疫及攻毒保护试验中,r VSVΔG-S经i.n.免疫诱导了强烈的体液免疫应答,攻毒后动物鼻甲及肺部病毒滴度显著降低,肺部得到了有效保护;r VSVΔG-S经i.n.免疫诱导的体液免疫应答及攻毒后保护效果均优于i.m.免疫。4.重组病毒载体疫苗在小鼠免疫试验中经i.n.免疫诱导的体液免疫水平较低,然而在金黄地鼠免疫试验中经i.n.免疫则诱导了强烈的体液免疫应答并实现了有效的免疫保护。原因在于金黄地鼠对SARS-CoV-2易感而小鼠不易感,因此重组疫苗经i.n.免疫后可在金黄地鼠呼吸道有效复制并引发免疫应答,而在小鼠呼吸道的复制效率较低。因此,金黄地鼠模型中i.n.免疫的免疫原性及攻毒保护结果更能反应重组病毒载体疫苗在其他SARS-CoV-2易感动物中的真实情况。本研究为SARS-CoV-2易感的伴侣动物、毛皮动物、家畜及珍稀野生动物提供了一种安全、有效、便捷的COVID-19候选疫苗。