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第一部分人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P1和P7启动子的克隆及序列分析目的克隆并测定人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因P1和P7启动子的序列。方法根据GenBank数据库提供的人ACAT1基因P1和P7启动子核苷酸序列,应用PCR方法从人单核细胞系THP-1细胞扩增分离出ACAT1基因P1和P7启动子全长片段,将PCR产物克隆入T载体,并对所获得的序列进行生物信息学分析。结果⑴经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,克隆的人ACAT1基因P1和P7启动子片段碱基序列与GenBank数据库一致,未发现突变。⑵获得的P1和P7启动子序列中,集中了一些转录因子结合元件的特征序列。结论成功克隆了人ACAT1基因P1和P7启动子,为研究在动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制奠定基础。第二部分人ACAT1基因P1和P7启动子调控的报告基因载体的构建及在不同细胞系中转录活性的检测目的构建人ACAT1基因P1和P7启动子调控的萤光素酶报告基因表达载体,检测其在不同细胞系中的转录活性的差别。方法从已构建的克隆载体pMD19-T-P1、pMD19-T-P7中分别双酶切出人ACAT1基因P1和P7启动子全长片段,将该基因亚克隆至表达载体pGL3-Enhancer。分别采用DEAE-dextran、Lipfectamine 2000、FuGENE 6、梭华-Sofast方法将pEGFP-N1转染入人单核细胞系THP-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪比较它们的转染效率。用DEAE-dextran法将重组质粒pGL3E-P1和pGL3E-P7分别转染入THP-1细胞,用脂质体Lipfectamine 2000将重组质粒pGL3E-P1和pGL3E-P7分别转染入人胚胎肾细胞HEK 293、人子宫颈癌细胞HeLa、人肝母细胞瘤细胞系HepG2, pGL3-Enhancer和pGL3-Control分别作为阴性对照组和阳性对照组,应用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果⑴PCR及酶切鉴定表明,获得的人ACAT1基因P1和P7启动子的DNA序列已成功载入重组表达载体pGL3E-P1和pGL3E-P7。⑵与Lipfectamine 2000、FuGENE 6、梭华-Sofast比较,DEAE-dextran介导的THP-1细胞基因瞬时转染效率更高。⑶pGL3E-P1和pGL3E-P7在THP-1和HepG2细胞中的转录活性高于HEK293和HeLa细胞,在THP-1细胞中转录活性最强,在HepG2细胞中的活性次之,在HEK293、HeLa细胞中活性低或不具有转录活性。结论⑴成功构建了含人ACAT1基因P1和P7启动子序列的荧光素酶报告基因载体,并可作为体外研究ACAT1基因转录调控的新手段。⑵获得效率较高的THP-1细胞基因瞬时转染的方法。⑶不同类型细胞中ACAT1基因P1和P7启动子的表达活性不同。第三部分胰岛素对人单核细胞ACAT1基因启动子活性的影响一、实时荧光定量RT-PCR检测胰岛素对人单核细胞ACAT1 mRNA表达的影响目的建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测人单核细胞系THP-1细胞中ACAT1 mRNA,探讨胰岛素对THP-1细胞ACAT1 mRNA表达的影响。方法体外培养THP-1细胞,用不同剂量的胰岛素与THP-1细胞持续孵育24h,用TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测ACAT1 mRNA的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算相对表达量。结果与未处理组相比,不同剂量胰岛素处理的THP-1细胞ACAT1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05,n=3),并随胰岛素剂量的增加而升高。结论⑴SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性良好的定量检测ACAT1 mRNA的方法。⑵胰岛素可明显促进THP-1细胞的ACAT1 mRNA的表达,其作用呈剂量依赖性。二、胰岛素对人单核细胞ACAT1基因启动子活性的影响目的研究胰岛素对THP-1细胞ACAT1基因P1、P7启动子的活性和P1、P7启动子转录产物表达的影响。方法将人ACAT1基因P1和P7启动子调控的报告基因载体pGL3E-P1和pGL3E-P7,通过DEAE-dextran法分别与内参照质粒pRL-TK共同转染入THP-1细胞,恢复生长7小时后给予胰岛素(10-7M)处理,40小时后通过双荧光素酶报告系统观察胰岛素对ACAT1基因P1和P7启动子的调控作用。体外培养THP-1细胞,用10-7M胰岛素与THP-1细胞持续孵育24h,用TRIzol提取总RNA后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测ACAT1基因P1和P7启动子转录产物表达。结果⑴胰岛素处理的THP-1细胞,与对照组相比,ACAT1基因P1启动子的荧光素酶表达活性显著增强,增强到2.6倍,具有显著差异(P<0. 01,n=3)。⑵与非胰岛素处理的对照组相比,胰岛素增强ACAT1基因P1启动子的转录产物量,升高到1.65倍,具有显著差异(P<0. 01,n=3),而P7启动子的转录产物量不发生显著变化。与上述结果相一致。结论胰岛素在人单核细胞中通过激活ACAT1基因P1启动子来上调其表达。第四部分人ACAT1基因P1启动子的功能分析及其不同长度的缺失体在胰岛素促进THP-1细胞ACAT1基因转录中的作用目的构建包含5’-端缺失不同长度人ACAT1基因P1启动子片段的荧光素酶报告基因载体,分析P1启动子的转录激活功能;探讨胰岛素对这一系列ACAT1基因P1启动子缺失体转录活性的影响。方法在对人ACAT1基因P1启动子进行生物信息学分析的基础上,设计8种ACAT1基因P1启动子缺失突变体,分别包括ACAT1基因P1启动子-547/+65、-498/+65、-428/+65、-363/+65、-324/+65、-256/+65、-188/+65、-125/+65bp的片段,针对每一种缺失突变体构建相应的萤火虫荧光素酶报告基因载体,分别命名为P1E-2、P1E-3、P1E-4、P1E-5、P1E-6、P1E-7、P1E-8、P1E-9,用DEAE-dextran法瞬时转染THP-1细胞,检测荧光素酶活性。给予胰岛素(10-7M)处理,检测这一系列ACAT1基因P1启动子缺失体转录活性的变化。结果⑴PCR、酶切及测序鉴定表明,成功获得8种人ACAT1基因P1启动子缺失突变体的荧光素酶报告基因载体P1E-2、P1E-3、P1E-4、P1E-5、P1E-6、P1E-7、P1E-8、P1E-9。⑵P1E-9在THP-1细胞中的转录活性均高于其他报告载体。⑶与非胰岛素处理的对照组相比,胰岛素增强人ACAT1基因P1启动子(P1E-1)的转录活性,升高到2.6倍,具有显著差异(P<0. 01,n=3),而其他8种P1启动子缺失突变体的报告载体转录活性不发生显著变化(P>0.05,n=3)。结论⑴成功构建了包含5’-端缺失不同长度人ACAT1基因P1启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并为体外研究ACAT1基因P1启动子的转录调控奠定了基础。⑵人ACAT1基因P1启动子的-125～+65bp区域是它的核心序列。⑶人ACAT1基因P1启动子5’-端上游-603～-548bp可能存在胰岛素反应元件。第五部分人ACAT1基因P1启动子的胰岛素反应元件的分析目的构建两种包含5’-端缺失不同长度人ACAT1基因P1启动子片段的荧光素酶报告基因载体;探讨胰岛素对这两个ACAT1基因P1启动子缺失体转录活性的影响,确定胰岛素反应元件。方法在对人ACAT1基因P1启动子进行生物信息学分析的基础上,针对转录因子c/EBPα、SNF、HNF-3结合元件,设计两种ACAT1基因P1启动子缺失突变体,分别包括ACAT1基因P1启动子-579/+65、-566/+65bp的片段,并构建相应的萤火虫荧光素酶报告基因载体,分别命名为P1E-10、P1E-11,用DEAE-dextran法分别与内参照质粒pRL-TK共同转染THP-1细胞。恢复生长7小时后给予胰岛素(10-7M)处理,40小时后通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。结果⑴PCR、酶切及测序鉴定表明,成功获得两种人ACAT1基因P1启动子缺失突变体的荧光素酶报告基因载体P1E-10、P1E-11。⑵与非胰岛素处理的对照组相比,胰岛素增强人ACAT1基因P1启动子(P1E-1)的转录活性,升高到2.6倍,具有显著差异(P<0. 01,n=3),而另外两种P1启动子缺失突变体的报告载体转录活性不发生显著变化(P>0.05,n=3)。结论⑴成功构建了包含5’-端缺失不同长度人ACAT1基因P1启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并可作为体外研究ACAT1基因转录调控的新手段。⑵人ACAT1基因P1启动子5’-端上游-603～-580bp存在胰岛素反应元件,可能为c/EBPα结合位点。