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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的，其主要特征是母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。1987年PRRS最先爆发于美国南部，随后在全球主要养猪国家流行。我国大陆于1996年首次报道此病并分离到病毒，随后该病在我国猪群广泛流行。2006年，我国南方猪群中暴发以高热、高发病率和死亡率等为特征的“高热病”，给我国养猪业造成巨大损失。随后证实该病的主要致病原是一种变异的PRRSV，并称其为高致病性PRRSV。截至到目前，中国猪群中存在了以下四种不同的PRRSV：即经典的PRRSV，经典PRRSV疫苗株，高致病性PRRSV和高致病性PRRSV疫苗株。这四种病毒株的存在给中国猪群中PRRSV的防控和净化带来很大困难。因此急需建立一株具有鉴别诊断意义的PRRSV疫苗株。NSP2蛋白是PRRSV基因组中变异率最大的非结构蛋白，不同的毒株之间NSP2区的长度也不相同，且NSP2区中含有病毒复制的非必需区域。因此，本试验在高致病性PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上，鉴定出该疫苗株NSP2区的复制非必需序列，并且分别构建了表达新城疫病毒NP基因部分抗原表位(NP49)或猪瘟病毒E2基因优势抗原表位的重组病毒，为进一步开发PRRSV标记疫苗和利用PRRSV基因组作为病毒载体奠定了基础。为探明高致病性PRRSV HuN4-F112疫苗株NSP2蛋白中间复制非必需区，本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上，采用突变PCR技术构建一系列NSP2缺失突变体，经体外克隆、拼接，构建了一系列缺失NSP2序列的感染性PRRSV cDNA克隆。用限制性内切酶Swa Ι将这些含有NSP2部分缺失的感染性克隆线性化后通过外转录获得病毒RNA，用脂质体法将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子，再转接到MARC-145细胞传代拯救病毒。对盲传到第三代的拯救缺失病毒进行RT-PCR扩增以鉴定缺失该区域对病毒复制的影响。对拯救成功的病毒进行分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和病毒生长特性的研究(噬斑特性、免疫荧光、病毒生长曲线)。结果显示缺失NSP2基因编码480~667位氨基酸的区域或小于此区域可以拯救出病毒，并且不影响病毒在MARC-145细胞的生长，但缺失病毒的生长曲线显示缺失该区域造成病毒早期的复制能力增强。以上结果为进一步利用NSP2蛋白的复制非必需区表达外源基因奠定了基础。为进一步研究利用NSP2缺失区表达外源基因，以两个NSP2复制非必需区缺失(480-532aa和508-532aa)的PRRSV HuN4-F112感染性分子克隆为骨架，采用突变PCR技术将新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) NP基因优势抗原表位区(49个氨基酸)和猪瘟病毒E2基因主要中和性抗原表位(15个氨基酸)分别插入PRRSV NSP2缺失的复制非必需区，经过与上述感染性克隆相似的全长cDNA组装和病毒拯救方法，在体外拯救出四株重组病毒，分别命名为rHuN4-F112-Δ480-532+NP49， rHuN4-F112-Δ508-532+NP49， rHuN4-F112-Δ480-532+E2ep和rHuN4-F112-Δ508-532+E2ep。对拯救的重组病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定，结果表明，四株拯救病毒均含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的外源基因序列(NP49或E2ep)。间接免疫荧光试验表明，外源基因均能在拯救的PRRSV中表达，且能够在其传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。将两株含有NDV NP49基因的重组标记病毒(rHuN4-F112-Δ480-532+NP49和rHuN4-F112-Δ508-532+NP49)免疫断奶后仔猪评价其免疫保护效果。20头断奶仔猪随机分成4组，每组5头，分别免疫rHuN4-F112-Δ480-532+NP49，rHuN4-F112-Δ508-532+NP49，疫苗株HuN4-F112(阳性对照组)和含2%胎牛血清的DMEM(阴性对照组)，实验组免疫剂量为105TCID50/头，阴性对照组免疫剂量为2mL。免疫28天后，用高致病性PRRSV HuN4株以3×104TCID50/头的剂量通过肌肉注射感染所有试验猪。攻毒后每天测量猪只的肛温并观察记录猪只的临床表现。免疫/攻毒后第1d，3d，5d，7d，10d，14d，21d，28d通过实时定量PCR方法检测猪血液中的病毒血症情况；免疫和攻毒后每隔7d通过ELISA方法检测猪只血清中抗PRRSV N蛋白、插入NDV NP49蛋白以及缺失的25aa多肽抗体的产生情况。攻毒28天后扑杀所有动物并记录数据统计两株疫苗的免疫保护情况。结果表明，免疫rHuN4-F112-Δ508-532+NP49重组标记病毒组和疫苗株HuN4-F112组获得完全保护，而免疫rHuN4-F112-Δ480-532+NP49重组标记病毒组获得60%的保护，阴性对照组全部死亡。ELISA试验结果表明，三组试验猪在免疫后14d均产生了针对PRRSV N蛋白的抗体；28d后两重组病毒免疫猪可以检测到抗NP49抗体，检测不到缺失25aa的抗体，但攻毒后可以检测到针对缺失25aa的抗体。本研究构建的一株含有NP49标记基因的重组PRRSV（rHuN4-F112-Δ508-532+NP49）可进一步开发为PRRSV标记疫苗，这对PRRSV的最终控制和净化具有重要意义。