研究目的经过多年的临床观察,我们发现原发性干燥综合征（pSS）患者出现焦虑症、抑郁症或合并焦虑状态、抑郁状态者非常多,这与患者因疾病引起的不适症状、药物的不良反应等均有密切关系。祖国医学中,郁责之于肝,郁证的发生与肝密切相关。故我们认为pSS以肝阴（血）不足、肝失疏泄为主要病机,提出以滋阴疏肝为治疗大法,运用一贯煎加减方治疗pSS阴虚肝郁证患者。本研究:1.在从肝论治,滋阴疏肝理论指导下运用一贯煎加减方治疗pSS阴虚肝郁证患者,通过临床观察和动物实验,从多角度系统探讨从肝论治,滋阴疏肝治疗pSS的理论和临床依据。2.通过JAK/STAT和NF-K B信号通路,观察不同剂量雷公藤甲素对NOD小鼠唾液腺损伤的疗效,探讨雷公藤甲素治疗pSS的机制。研究方法1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究本研究选择60例江苏省中医院已经确诊的pSS阴虚肝郁证患者,10例健康对照者为研究对象,取pSS阴虚肝郁证患者及健康对照者外周血5-10ml,检测B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平及IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和IL-27水平。再将pSS阴虚肝郁证患者分为2组,试验组30例,对照组30例,分别服用一贯煎加减方及羟氯喹,观察治疗前后的临床疗效,以及测定治疗后B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平以及血清IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10 和 IL-27 水平。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响选择NOD小鼠60只及正常ICR小鼠10只,NOD小鼠随机分为6组,每组10只,即模型组、高浓度复方药组、中浓度复方药组、低浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组,ICR小鼠为正常组。观察小鼠每天饮水量,每周测定小鼠唾液流量,8周后处死小鼠,计算脾指数、颌下腺指数,测定每组小鼠外周血B细胞活化、分化表面标记、Tfh细胞比率、B细胞增殖能力、B细胞凋亡水平以及血清IgG、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、BAFF和IL-27水平。3.雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究选择雌性NOD小鼠48只,随机分为4组,每组12只,即对照组（安慰剂）小剂量TP组、中剂量TP组、大剂量TP组。每隔2周检测小鼠唾液分泌量。90天后处死小鼠,取唾液腺和脾脏称重,计算唾液腺指数和脾脏指数;检测TNF-α、IL-2和IL-6;取唾液腺,评价组织病理学;分析小鼠唾液腺淋巴细胞分布;进行脾脏T细胞和B细胞增殖试验;提取唾液腺组织蛋白,检测蛋白表达情况。研究结果1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究1.1对ESR、CRP、球蛋白、免疫球蛋白的影响:治疗12周后,治疗组血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG与治疗前比较有显著差异（P<0.05）,IgA、IgM与治疗前比较无显著差异（P>0.05）。对照组血沉、球蛋白、IgG与治疗前比较有显著差异（P<0.05）,C反应蛋白、IgA、IgM无显著差异（P>0.05）。治疗组治疗后与对照组治疗后比较,血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG、IgA、IgM均无显著差异（P>0.05）。1.2对泪流量、唾液流率的影响:治疗12周后,治疗组双眼泪流量、唾液流率与治疗前比较有显著差异（P<0.05）,对照组双眼泪流量、唾液流率与治疗前比较无显著差异（P>0.05）,治疗组治疗后与对照组治疗后比较,双眼泪流量、唾液流率有显著差异（P<0.05）。1.3对焦虑、抑郁自评量表的影响:治疗12周后,治疗组焦虑、抑郁自评量表与治疗前比较有显著差异（P<0.05）,对照组焦虑、抑郁自评量表与治疗前比较无显著差异（P>0.05）,治疗组治疗后与对照组治疗后比较,焦虑、抑郁自评量表有显著差异（P<0.05）。1.4对外周血B细胞活化的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞活化率均显著增加,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞活化率均显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞活化率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.5对外周血B细胞分化的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞分化率均显著提升,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞分化率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.6对外周血Tfh细胞比率的影响:治疗前,与健康对照者比较,对照组和对照组外周血Tfh细胞比率（Q2象限）显著升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血Tfh细胞比率均显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血Tfh细胞比率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.7对外周血B细胞增殖的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞增殖率显著升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞增殖率均显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞增殖率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.8对外周血B细胞凋亡的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率均显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组外周血B细胞凋亡率组间差异无统计学意义（P>0.05）。1.9对血清细胞因子的影响:治疗前,与健康对照者比较,治疗组和对照组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ等炎症细胞因子水平均显著增加,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与治疗前比较,治疗后,治疗组和对照组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ等炎症细胞因子水平均显著降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）;但治疗组和对照组上述指标的组间差异均无统计学意义（P均>0.05）。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响2.1对NOD小鼠饮水量、唾液流量、脾脏指数、颌下腺指数的影响:与空白组相比,NOD小鼠饮水量增加,唾液流量减少,脾脏指数、颌下腺指数基本相同。2.2对外周血B细胞活化的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞活化率显著增加差异具有统计学意义（P<0.05）,与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞活化率均有降低,其中低浓度复方药组差异无统计学意义（P>0.05）,中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异均具有统计学意义（P均<0.05）。2.3对外周血B细胞分化的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞分化率均有所提升,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组、雷公藤组无统计学差异（P均>0.05）;高浓度复方药组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.4对外周血Tfh细胞比率的影响:与空白组比较,模型组外周血Tfh细胞比率（Q2象限）显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血Tfh细胞比率均有所降低,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组、雷公藤组差异无统计学意义（P均>0.05）;高浓度复方药组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.5对外周血B细胞增殖的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞增殖率显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞增殖率均有所降低,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组无统计学意义（P均>0.05）,高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异有统计学意义（P均<0.05）。2.6对外周血B细胞凋亡的影响:与空白组比较,模型组外周血B细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞凋亡率均有所下降,其中低浓度复方药组、中浓度复方药组无统计学差异（P均>0.05）;高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组差异具有统计学意义（P均<0.05）。2.7对血清细胞因子的影响:与空白组比较,模型组BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27水平明显升高,差异有统计学意义（P均<0.05）;与模型组比较,低浓度复方药组、中浓度复方药组、高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组上述指标均有所下降,其中低浓度复方药组 BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平无统计学差异（P 均>0.05）;中浓度复方药组IL-4水平无统计学差异（P>0.05）,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-6、IL-10、IL-27水平有统计学差异（P均<0.05）;高浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平均有统计学差异（P 均<0.05）。3·雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究3.1 TP对NOD小鼠唾液腺指数、脾脏指数和唾液流量的保护作用:TP组NOD小鼠唾液腺指数显著高于对照组,脾脏指数明显低于对照组。对照组NOD小鼠唾液流量随时间延长而降低。第6～12周唾液流速明显低于TP组。随着TP浓度的增加,唾液流速与对照组相比差异较大。3.2 TP抑制NOD小鼠自身免疫损伤:TP治疗组有少量淋巴细胞浸润,无淋巴结形成。组织病理学评分分别为2.4±0.18、1.8±0.17和1.5±0.19。与对照组相比,TP治疗组NOD小鼠血清中IgG、IgM、IL-2、IL-6和TNF-α抗体水平显著降低。CD4+、CD8+和B220+/CD45+细胞显著减少。与0.05%二甲基亚砜相比,TP处理的NOD小鼠脾脏中T细胞和B细胞的增殖显著降低。3.3 TP抑制NOD小鼠唾液腺JAK/STAT和NF-κB信号通路:Western blot结果显示,TP通过抑制JAK1/2和STAT的磷酸化显著抑制JAK/STAT信号通路;通过抑制p65和Iκ Bα的磷酸化显著抑制NF-κB信号通路。3.4 TP通过抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路降低IFN-γ诱导的唾液腺上皮细胞炎症损伤:10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml的TP处理72h后,细胞活性无明显变化。TP显著抑制炎症因子的表达。TP对JAK1/2、STAT3、IκBα、NF-κB的表达水平无明显影响,但p-JAK1/2、p-STAT3、p-IκBα 和 p-NF-κB被显著抑制（p<0.001）。结论1.一贯煎加减方对原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者疗效及B淋巴细胞影响的临床研究1.1与健康人相比,pSS患者B细胞活化、增殖、凋亡明显增加,记忆B细胞减少,Tfh细胞比率明显增高,经过治疗后B细胞活化数量减少,增殖水平下降,凋亡减少,记忆B细胞增多,浆细胞减少,血Tfh细胞比率降低。1.2pSS患者血清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ细胞因子水平增加,经治疗后IL-4、IL-6、IL-10、IL-27、IFN-γ细胞因子水平降低。1.3一贯煎加减方能降低pSS患者血沉、C反应蛋白、球蛋白、IgG指数,对B淋巴细胞有调节作用,与羟氯喹相比未见明显统计学差异,但在改善患者干燥症状及情绪方面显示出了较好疗效。为一贯煎加减方治疗原发性干燥综合征阴虚肝郁证患者提供了较好的理论基础。2.一贯煎加减方对NOD小鼠B淋巴细胞的影响2.1与空白组相比,NOD小鼠饮水量增加,唾液流量减少,脾脏指数、颌下腺指数基本相同。2.2 NOD小鼠外周血B细胞活化率、外周血Tfh细胞比率、外周血B细胞增殖率、外周血B细胞凋亡率显著增加,外周血B细胞分化（分化为记忆B细胞）率显著降低,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27 水平明显升高。2.3低、中、高不同浓度复方药组、雷公藤组、羟氯喹组外周血B细胞活化率、外周血Tfh细胞比率、外周血B细胞增殖率、外周血B细胞凋亡率均有所降低,外周血B细胞分化率均有所提升,BAFF、IFN-γ、IgG、IL-4、IL-6、IL-10、IL-27水平亦有所下降。其中高浓度复方组、雷公藤组、羟氯喹组显示出了较好的疗效。3.雷公藤甲素（TP）通过JAK/STAT和NF-κB信号通路减轻NOD小鼠唾液腺损伤的研究3.1随着年龄的增长,对照组NOD小鼠的唾液流量逐渐降低,唾液腺内出现更严重的淋巴细胞浸润性病变。小鼠血清中IgG和IgM浓度逐渐升高,炎症因子表达增加。3.2与对照组相比,TP治疗组明显改善了唾液腺流速,减少了淋巴细胞浸润,IgG和IgM浓度及炎性因子的表达。TP抑制了T、B淋巴细胞增殖,改善NOD小鼠干燥症状,且没有明显的组织损伤。3.3 TP通过抑制JAK/STAT途径和NF-κB途径,减轻NOD小鼠的炎症反应和组织损伤。