纤溶酶高产菌株的分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究

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血栓性疾病是目前临床上死亡率最高的疾病,寻找高效、安全的溶血栓药物一直是世界医药行业关注的热点。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段。目前临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类,尽管这些药物的疗效肯定,但还存在许多缺陷,而且价格昂贵。因此研制高效、快速、副作用小、价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。本文以脱脂奶粉作为初筛底物,以自制纤维蛋白作为复筛底物,从保定某屠宰厂附近的土壤中筛得一高产菌株ZLW-2。在此筛选过程中,建立了一套简便、快速、准确的纤溶酶高产菌株筛选方法。经菌落形态和菌体形态观察、芽孢的电子显微镜观察以及生理生化鉴定,初步鉴定为芽孢杆菌属。通过血平板试验发现菌株ZLW-2没有产生溶血现象,说明此菌株的安全性较高。对其进行菌种传代产酶稳定性试验,结果证明菌株ZLW-2产酶性能稳定,传代10次,酶活力均在165.82 U/mL左右。提出了一种快速、客观的纤溶酶活力测定程序。对于纤溶酶活的测定方法,国内外学者使用最多的是纤维蛋白平板法。纤维蛋白平板法最直接,但周期较长,而且由于制备平板时所用的试剂或尿激酶标准品不同,所得的结果可比性差。本试验采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了测定酶活力的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。在摇瓶发酵水平上,对芽孢杆菌ZLW-2的发酵产酶条件进行了研究,确定了其最佳培养基成分及最佳培养条件。研究了不同碳源、氮源、磷酸盐、金属离子、表面活性剂等因素对芽孢杆菌ZLW-2产酶的影响,发现可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸二氢钠浓度对产酶的影响较大。对可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸二氢钠三因素各选取三个水平进行正交试验,确定芽孢杆菌ZLW-2产酶的最佳培养基成分为:可溶性淀粉7.0%、蛋白胨7.0%、磷酸二氢钠1.5%、硫酸镁0.01%、CaCl2 10μmol/L。通过摇瓶发酵试验,确定其最佳培养条件为:摇床32℃,225r/min,发酵培养基的起始pH值为8.0,接种量为2%,装液量为40 mL/300 mL,培养52h。经过发酵工艺优化,芽孢杆菌ZLW-2的产酶活力可达547.95 U/mL,是优化前酶活力的3.13倍。酶学性质研究发现,芽孢杆菌ZLW-2的基本酶学性质为:最适温度为50℃,70℃保温60 min,酶活力仍有11%。最适pH值为8.0。该酶在偏碱pH 7.0~8.0环境下较稳定。在4℃环境中放置30 d后,酶活力仍有91%;在-20℃冰箱冻藏,30 d酶的残余酶活力仍有83%。金属离子中,Pb2+、Mn2+对纤溶酶有轻微抑制;Ca2+、Cu2+、Fe2+对纤溶酶有不同程度的激活。EDTA试验显示,它不是金属蛋白酶。
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