目的焦虑症(Anxiety disorder)又称之为焦虑性神经症(Anxiety neurosis),是一种以焦虑情绪为主的神经疾病,以持续性的焦虑、紧张、惊恐不安等焦虑情绪为表现,并且伴有自主神经紊乱、肌肉紧张以及运动不安等症状。焦虑症在临床上主要分为广泛性焦虑症(Generalized anxiety disorder,GAD)、惊恐障碍(Panic disorder,PD)、社交恐惧症(Social anxiety disorder,SAD)、强迫症(Obsessive compulsive disorder,OCD)、创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)和广场恐惧症(Agoraphobia)等。焦虑症发病率逐年增加,已成为现代疾病谱的常见病和多发病,严重影响人们的生活质量,因此抗焦虑药物及作用机理研究逐渐成为学术界研究热点。黑果枸杞来源于茄科枸杞属植物黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)的成熟果实,在藏医药经典著作《四部医典》、《晶珠本草》中均有记载,性平、味甘,功效清心热,主治心脏病、妇科病、月经不调等。白刺来源于蒺藜科白刺属植物白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的成熟果实,其地域分布、外形、口感、功效与黑果枸杞相似,而藏药中两者也可混用替代,均称之为"旁玛"。黑果枸杞和白刺均富含花色苷类天然成分,现代药理学研究认为,花色苷作为一种类黄酮物质,具有显著的生理活性如清除自由基和抗氧化、预防心血管疾病、预防神经退行性疾病和改善认知提高记忆力等。富含花色苷类成分的黑果枸杞和白刺是否具有抗焦虑的潜力,抗焦虑药效如何?主要的抗焦虑作用机制是什么?这些问题很值得我们研究。方法1.制备黑果枸杞提取物(LRE)和白刺提取物(NTE),采用大孔树脂吸附法富集和除杂,采用pH示差法对LRE和NTE中的总花色苷含量作定量分析。2.通过小鼠高架十字迷宫实验(EPM)、小鼠明暗箱实验(LDB)、空瓶应激(EBS)致焦虑大鼠行为学实验以及束缚应激(RS)焦虑大鼠行为学实验,探究和比较黑果枸杞提取物(LRE)和白刺提取物(NTE)抗焦虑药效。3.基于空瓶应激致焦虑大鼠模型探讨比较LRE和NTE对大鼠血清下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的影响。4.基于束缚应激致焦虑大鼠模型探讨比较LRE和NTE对大鼠皮层和海马脑内源性营养因子(BDNF)蛋白表达和胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的影响,对海马凋亡相关因子表达的影响,对海马神经元再生增殖的影响。结果主要研究内容及结果如下:1.LRE和NTE的制备1.1 LRE和NTE的提取参考文献方法,实验确定LRE和NTE的提取条件为:25倍含2%甲酸的80%乙醇溶液50℃避光浸提两次,每次3 h。1.2 LRE和NTE的纯化 AB-8大孔树脂吸附法除杂和富集,回收溶剂冷冻干燥,得率分别为8.04%和5.02%。1.3 LRE和NTE的含量测定采用pH示差法对LRE和NTE中的总花色苷含量作了定量分析,结果表明,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计,LRE和NTE中的总花色苷含量分别为 439.07±4.61 mg/100g 和 222.13±1.70 mg/100 g(以生药量计,干重)。2.药效学研究2.1 LRE和NTE对小鼠抗焦虑作用研究小鼠高架十字迷宫实验结果显示,与空白对照组相比,LRE的剂量为320 mg/kg/d、NTE的剂量为400 mg/kg/d时,可显著增加进入开臂时间和次数百分比。明暗箱实验结果显示,与空白对照组相比,LRE的剂量为320mg/kg/d、NTE的剂量为400mg/kg/d时,可显著增加小鼠在明箱中的时间与进入明箱中的次数。2.2 LRE和NTE对空瓶应激致焦虑大鼠抗焦虑作用研究实验结果表明,与空白对照组相比,模型组可显著降低大鼠进入高架十字迷宫开臂时间百分比和开臂次数百分比以及大鼠进入旷场中央区的次数和在中央区停留的时间,说明造模成功。空瓶应激后高架十字迷宫实验结果表明,同模型组相比,LRE低、高剂量组和NTE低、高剂量组进入开臂次数均显著升高;LRE低、高剂量组和NTE高剂量组进入开臂时间均显著升高。空瓶应激后旷场实验结果表明,同模型组相比,LRE低、高剂量组和NTE低、高剂量组进入中央区次数均显著升高;LRE高剂量组、NTE高剂量组进入中央区时间均显著升高。2.3 LRE和NTE对束缚应激致焦虑大鼠抗焦虑作用研究采用束缚应激对大鼠进行焦虑造模,应用高架十字迷宫实验(EPM)进一步评价和比较LRE和NTE的抗焦虑作用。实验结果表明,与空白组相比,模型组显著降低大鼠开臂次数和时间百分比,说明造模成功,大鼠出现焦虑情绪。与模型组相比,LRE低、高剂量组显著增加大鼠进入开臂次数和时间百分比。与模型组相比,NTE低剂量组可显著增加大鼠进入开臂次数百分比;NTE高剂量组可显著增加大鼠进入开臂次数和进入开臂时间百分比。3.机制探讨3.1 LRE和NTE对空瓶应激模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响。采用酶联免疫吸附法检测了 LRE和NTE对空瓶应激大鼠血清HPA轴相关激素促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)含量,结果显示,大鼠空瓶应激模型能引起HPA轴亢进,表现为CRF、ACTH、CORT含量相较于空白组显著增加。与模型组相比,LRE低剂量组和高剂量组以及NTE高剂量组能显著降低空瓶应激大鼠血清HPA轴各激素含量。据此推测LRE和NTE抗焦虑作用的机制可能是:抑制应激所造成的HPA轴各激素含量升高,缓解HPA轴的过度亢奋,从而达到抗焦虑作用效果。3.2 LRE和NTE对束缚应激模型大鼠脑内ERK/MAPK通路的影响。通过蛋白印迹法检测LRE和NTE对束缚应激致焦虑模型大鼠脑内ERK/MAPK通路的影响,即胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平变化。结果表明,与空白组相比,模型组大鼠皮层和海马中的P-ERK与p-CREB水平显著升高;与模型组相比,LRE低剂量组和高剂量组可显著减少大鼠皮层和海马中p-ERK与p-CREB的表达水平,NTE高剂量组可显著减少大鼠皮层和海马中p-ERK与p-CREB的表达水平。这一结果提示LRE和NTE可能通过调节ERK/MAPK通路发挥其抗焦虑作用。3.3 LRE和NTE对束缚应激模型大鼠脑内BDNF蛋白表达的影响。通过蛋白印迹测定法检测了 LRE和NTE对束缚应激致焦虑模型大鼠海马和皮层BDNF蛋白表达的影响,结果显示,与空白组相比,模型组的BDNF表达水平显著下降,与模型组相比,LRE低剂量组和高剂量组以及NTE高剂量组能使大鼠的BDNF表达水平显著上升,这表明,BDNF参与了束缚应激致焦虑信号,而LRE和NTE可通过调节BDNF产生抗焦虑作用。此外,文献报道,ERK/MAPK通路与BDNF蛋白的表达关系密切,ERK/MAPK通路的变化可以影响BDNF蛋白含量的表达,而实验结果表明LRE和NTE对ERK/MAPK通路和BDNF蛋白的表达都有显著的影响,因此提示LRE和NTE也可能通过调节它们的相互作用而发挥其抗焦虑药效。3.4 LRE和NTE对束缚应激模型大鼠海马神经元凋亡相关因子的影响。通过蛋白印迹法检测了 LRE和NTE对束缚应激致焦虑模型大鼠海马凋亡相关因子Bax和Bcl-2表达的影响。实验结果显示,与空白组相比,模型组凋亡抑制因子Bcl-2显著降低,而促凋亡因子Bax表达显著增加,提示束缚应激造模可能诱导大鼠海马神经元细胞的凋亡。与模型组相比,LRE高剂量组和NTE高剂量组均能显著降低大鼠海马中促凋亡因子Bax的蛋白表达水平,LRE低剂量组和高剂量组以及NTE低剂量组和高剂量组均能显著增加大鼠海马中凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达水平。有研究认为,大鼠海马BDNF蛋白表达与凋亡相关因子的表达有较强的相关性,结合实验结果,提示束缚应激造模可能会影响动物海马BDNF蛋白和凋亡相关因子的表达水平,而花色苷类成分LRE和NTE可能通过影响动物神经元的凋亡和BDNF蛋白的表达而起到抗焦虑的神经生物学效应。3.5 LRE和NTE对束缚应激模型大鼠海马神经元再生增殖的影响。在束缚应激后高架十字迷宫实验结束后,各组大鼠腹腔注射5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)标记海马S期先祖细胞,以反映齿状回(DG区)细胞的增殖情况,断头取脑,制作石蜡切片,进行免疫组织化学处理,对各组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞进行计数。实验结果显示,与空白组相比,模型组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞计数显著降低,提示束缚应激造模减少了大鼠海马齿状回细胞增殖。与模型组相比,LRE低剂量组和高剂量组以及NTE高剂量组能显著增加海马齿状回BrdU阳性细胞计数,提示预给药LRE和NTE可减缓大鼠因束缚应激造成的海马齿状回细胞增殖减缓,从而达到促进海马神经元细胞再生增殖的效果。结论本课题分别采用两个经典小鼠行为学实验(EPM、LDB)探讨比较LRE和NTE的抗焦虑药效,并通过空瓶应激致焦虑模型和束缚应激致焦虑模型的大鼠行为学实验对LRE和NTE的抗焦虑作用进行了进一步的验证。结果表明,LRE和NTE在以上各个不同模型上均表现出稳定的抗焦虑作用;同剂量条件下,LRE较NTE表现出更稳定的抗焦虑药效。在机制探讨方面,通过探讨比较LRE和NTE对空瓶应激后大鼠HPA轴的影响,推测它们可能通过抑制模型动物HPA系统功能亢进来减轻动物焦虑状态;通过探讨比较LRE和NTE对束缚应激后大鼠脑内BDNF/ERK/MAPK通路的影响,对海马凋亡相关因子的影响,对海马神经元再生增殖的影响,推测LRE和NTE可能通过抑制ERK和CREB的过度磷酸化,促进BDNF蛋白的表达,调节海马凋亡相关因子表达,促进海马神经元再生增殖,进而提高海马神经元可塑性来达到抗焦虑的作用。通过以上研究,明确LRE和NTE抗焦虑作用和探讨相关的作用机制,为它们有效应用于抗焦虑药物的研发提供实验依据。