研究背景Graves眼病(Graves’ophthalmopathy, GO),亦称甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy, TAO)是一种器官特异性自身免疫性疾病,其确切病因和发生机制尚不清楚,临床上主要表现为眼球突出、眼痛、眼外肌运动障碍、眶周水肿,严重者甚至失明,GO的组织学特征是眶周组织淋巴细胞浸润,活化的T淋巴细胞、巨噬细胞合成并释放大量的细胞因子到组织中,细胞因子刺激成纤维细胞增生和释放糖胺聚糖(Glycosaminoglycans, GAGs)引起眼眶局部的炎症,GAG导致球后组织及眼外肌的水肿,导致眼球突出,引起畏光、流泪、眼球运动障碍等临床症状。目前对活动性GO的诊断评估主要根据欧洲Graves眼病协会(EUGOGO)提出的CAS评分标准,主要包括自发性球后疼痛；眼球运动后疼痛；眼阜水肿；眼睑水肿；结膜水肿；眼睑红斑；结膜充血7项评估内容,受主观及外界影响因素较大。由于对GO活动性及病情严重程度的评估手段有限,Graves眼病目前仍是临床上治疗比较棘手的眼病之一。研究发现,GO在活动期以Thl细胞(T helper type1cell)免疫反应为主,而静止期以Th2细胞(T helper type2cell)免疫反应为主。近年新发现一组CD4+效应T细胞亚群,即Thl7细胞,以产生大量白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)为特征,与免疫相关疾病有密切关系。IL-17是由TH17细胞分泌,主要功能是作为一种前炎症细胞因子通过诱导靶细胞产生趋化因子、集落刺激因子(colony stimulating factor),具有促炎症作用,引起组织细胞的浸润和破坏。目前关于IL-17的研究大多集中在免疫调节作用上的研究,IL-17作为一种促炎性细胞因子,通过特异性地结合受体,并激活NF-κB和MAP激酶(mitogen act ivatedprotein kinase, MAPK),诱导促炎细胞因子、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotatactic protein, MCP-1)、细胞间粘附分子(intercellularadhesion molecule, ICAM)、前列腺素E2的表达,导致炎性细胞浸润和组织损伤,促进炎症发展、免疫应答等多种生物学功能。研究发现IL-17在多种自身免疫性疾病的血清及组织中均高表达,提示IL-17可能参与了多种自身免疫性疾病的发病过程。已有研究发现类风湿性关节炎(RA)患者关节滑液中的IL-17含量明显高于骨性关节炎患者滑液中的IL-17含量。且在系统性红斑狼疮(SLE)中,IL-17的水平与该病的活动性存在一定的相关性。也有研究发现IL-17在GO患者的血清中高表达,并与疾病活动性呈正相关关系,但该研究并未测定在Graves病中是否也有IL-17的高表达。MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA,前体miRNA由Drosha复合物在胞核中切割初级miRNA形成,然后前体miRNA被核转运蛋白转运至胞质,并在核酸内切酶Dicer酶的作用下,茎环结构被剪切,最后产生一种双链miRNA。其中一条成熟的单链miRNA保留在RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)中,另一条则被降解。成熟的miRNA则通过和靶基因3’非翻译区(3’UTR,3’untranslational region)结合,引导RNA诱导的沉默复合体(RISC, RNA-induced silencing complex)降解其靶mRNA或阻碍靶基因的翻译。研究显示一系列RNA(microRNA, miRNA)直接或间接参与了固有性和适应性免疫应答,从而可能在自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要的负调控作用。MiRNA不仅和正常免疫应答有关,也和异常免疫应答如炎症和自身免疫性疾病有关。有学者将miR-146a的表达载体接入了白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的3’UTR的报告系统载体并共转染293T细胞后,可观察到荧光素酶的水平有所降低,提示miR-146a作为一个负调控分子,在转录后水平抑制IRAK1的水平,从而对免疫信号转导起到反馈调节作用。而相关研究发现miR-146a可能参与了类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发病机制。在多种自身免疫性疾病中,miR-146a的表达与IL-17的表达量呈一定的相关关系,且作为miR-146a的靶基因,IRAK1在产生IL-17的T细胞中受到miR-146a的负性调控。在Graves(?)病的发生发展过程中,是否也有miR-146a和IL-17的参与,它们与GO的临床活动性的关系仍有待进一步研究,因此本文探讨循环中miR-146a和IL-17在Graves眼病的发病过程中的表达特征及其与疾病临床活动性的关系。第一部分IL-17在Graves眼病患者血清中的表达特征及临床意义目的通过测定活动性GO组、非活动性GO组、GD不伴眼病组和同期健康对照组血清中IL-17的表达水平,探讨IL-17在Graves眼病患者中的表达特征及其与疾病临床活动性的相关性。方法(1)实验共分为4组,分别是：活动性GO组、非活动性GO组、GD不伴眼病组和同期健康对照组；选取未经激素及免疫抑制剂治疗的活动性GO患者(CAS≥3)14例；非活动性GO患者(CAS<3)13例；同期非突眼Graves病患者(GD组)15例；健康对照组15例；收集各组的临床数据。(2)收集各组外周血,分离出血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清中IL-17的表达水平,并分别与CAS、TRAb及突眼度进行相关性分析。(3)统计分析：采用SPSS13.0进行统计分析。计量资料数据以均数±标准差((?)±s)表示,以α=0.05作为检验水准,以P<0.05为差异有统计学意义。多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行多重比较。符合正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布的资料,采用Spearman等级相关分析。结果(1)GD不伴眼病组、非活动性GO组及活动性GO组患者血清IL-17的表达水平均显著高于正常对照组,差异均具有统计学意义(均为P<0.001),其中活动性GO患者的表达水平最高,为9388.1±2811.1pg/L。活动性GO患者血清IL-17的水平高于非活动性GO患者,差异具有统计学意义(9388.1±2811.1pg/L vs.6698.9±1214.7pg/L,P=0.024).活动性GO患者血清IL-17水平也高于GD组(9388.1±2811.1pg/L vs.5266.9±1781.6pg/L,P=0.001).而非活动性GO组与GD组之间则无统计学差异(6698.9±1214.7pg/L vs.5266.9±1781.6pg/L,P=0.104)。(2)相关性分析：在GO患者中,血清IL-17的表达水平与临床活动性评分(CAS)呈显著的正相关(r=0.869,P<0.001),但与突眼度、TRAb之间无显著性关联(r=0.258, P>0.05; r=0.003, P>0.05)。结论血清中的IL-17的表达水平在GO患者和GD患者中均显著高于正常对照组,其中活动性GO组最高,并与临床活动性评分(CAS)呈正相关,提示虽然IL-17不是GO的特异性指标,但与G0的活动性及病情的严重程度相关,可望作为评价GO患者临床活动性的新指标。第二部分血浆中miR-146a和血清中IRAK1在Graves眼病患者中的表达特征及相关指标相关性分析目的测定活动性GO组、非活动性GO组、GD不伴眼病组(GD组)和同期健康对照组的血浆中miR-146a和血清中miR-146a的靶基因IRAK1的表达水平,探讨miR-146a在Graves(?)病患者中的表达特征及其与临床活动性的相关性,同时初步分析miR-146a与IL-17在Graves眼病中的相互关系。方法(1)实验分组同第一部分,即活动性GO组、非活动性GO组、GD不伴眼病组(GD组)和同期健康对照组；选取未经激素及免疫抑制剂治疗的活动性GO患者(CAS≥3)14例；非活动性GO患者(CAS<3)13例；同期非突眼Graves病患者(GD组)15例；健康对照组15例；收集各组的临床数据。(2)收集各组外周血,分离出血浆和血清,用实时荧光定量PCR检测血浆中miR-146a的表达水平,以2-△△Ct计算目的基因miR-146a的相对表达量,用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清中IRAK1的表达水平。并分别分析miR-146a与IL-17、IRAK1、CAS评分、GO患者的突眼度及TRAb的相关性。(3)统计分析：采用SPSS13.0进行统计分析。计量资料数据以均数±标准差((?)±s)表示,以α=0.05作为检验水准,以P<0.05为差异有统计学意义。多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行多重比较。符合正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布资料的相关分析采用Spearman等级相关分析。结果(1)血浆中miR-146a的表达水平：与正常对照组相比,GD组miR-146a的相对表达量无统计学差异(P=0.208),活动性GO组患者及非活动性GO组患者miR-146a的相对表达量均显著下调(P=0.002,P=0.009),其中活动性GO组比非活动性GO组表达量更低,下调率分别为96.72%和80.24%(P<0.05)。(2)血清中IRAK1表达水平：与正常对照组相比,GD组血清中IRAK1的表达量差异无统计学意义(0.73±1.09ng/ml vs.1.08±0.83ng/ml,P=0.325),而活动性GO组、非活动性GO组血清中的IRAK1的表达水平均比正常对照组明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.001,P<0.001)。活动性GO组比非活动性GO组的IRAK1水平更高(3.41±0.86ng/ml vs.2.41±1.07ng/ml,P=O.01)。与GD组相比,活动性G0组的IRAK1的表达量也显著升高(1.08±0.83ng/ml vs.3.41±0.86ng/ml,P=0.035)。而非活动性GO组与GD组之间的IRAK1的表达水平差异也存在统计学意义(2.41±1.07ng/ml vs.1.08±0.83ng/ml,P=0.047)。(3)相关性分析：在GO患者中,miR-146a的相对表达量与其靶基因IRAK1及IL-17的表达量呈显著的负相关关系(r=-0.515,P=0.007；r=-0.563,P=0.003)。且miR-146a的表达量与CAS评分也呈显著的负相关关系(r=-0.738,P<0.001)。而miR-146a与GO患者的突眼度及TRAb均无显著的相关关系(r=0.16,P>0.05; r=0.197, P>0.05).结论在GO患者外周血血浆中miR-146a的表达明显下调,且与其靶基因IRAK1及IL-17的表达量也呈显著的负相关,并且与CAS呈显著的负相关,提示miR-146a也可能参与了GO的发病过程,也有望成为GO活动性的评估指标。