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目的:本研究通过对不同年龄的SD雄性大鼠进行GnRH主动免疫并结合体外培养下丘脑神经元及胸腺细胞,探索GnRH主动免疫对下丘脑—垂体—性腺—胸腺环路的作用及其调节机制。 方法:(1)将人工合成的GnRH并列休偶联在卵清蛋白载体上,辅以铝胶佐剂,分别对照组和免疫组的18~20d、28d和8月龄SD大鼠按100μg/只多点皮下注射,每两周加强免疫一次,共免疫3次。(2)在最后一次免疫后,每2周尾静脉采血,用酶联免疫吸附法(ELESA)检测血清中GnRH特异性抗体;2个月后,多聚甲醛溶液心脏灌注,取下丘脑、睾丸、精囊腺和前列腺,分别称重,对睾丸组织切片和HE染色,分析GnRH主动免疫对不同年龄大鼠睾丸和部分附性腺的形态影响;分别对下丘脑进行组织匀浆和冰冻切片,ELISA检测匀浆液上清中GnRH浓度;免疫荧光双染法观察GnRH主动免疫后GnRH神经元和胶质细胞的分泌活性。(3)在28d大鼠最后一次加强免疫后1个月和2个月时,每组麻醉处死6只大鼠,取全血和胸腺,并培养大鼠胸腺原代细胞,添加GnRH受体拮抗剂;用CD3、CD4、CD8和CD25直标荧光抗体标记血液和胸腺组织细胞中T淋巴细胞,流式绌胞仪检测血液和胸腺中T淋巴细胞的分型变化。(4)28d大鼠在最后一次加强免疫后每2周每组麻醉处死8只,心脏取血,离心制备血清,左侧胸腺组织匀浆取上清,放射免疫法(RIA)检测 FSH、LH,ELISA检测GnRH;大鼠右侧胸腺组织和胸腺原代培养细胞液氮冻存,实时荧光定量PCR检测胸腺组织中FSHR、LHR、AR和GnRHR的mRNA表达,并在免疫1个月和两个月时,每组取4只大鼠胸腺用多聚甲醛固定,免疫组织化学染色,检测上述生殖激素受体在胸腺内的定性表达和蛋白水平。(5)取28d试验大鼠下丘脑和血清,ELISA检测下丘脑组织上清中GnRH和Thymulin及血清中Thymulin的变化;免疫荧光双染观察GnRH神经元和神经胶质细胞的表达活性。分离培养GnRH神经元,添加不同浓度的胸腺激素Thymulin,ELISA检测培养上清巾GnRH的浓度;激光共聚焦观察培养神经元形态和分泌活性。 结果:(l) GnRH主动免疫的18~20d大鼠产生高滴度抗体时间较8月龄大鼠长,血清睾酮浓度一直处于极低水平(P<0.01),睾丸巾曲细精管多数变形,管腔内细胞稀薄;8月龄免疫大鼠血清睾酮随免疫时间的延长而逐渐降低,睾丸曲细精管外形正常,但管内壁细胞明显萎缩、退化。18~20d免疫大鼠下丘脑GnRH神经元的分泌活性显著受到抑制(P<0.01),下丘脑室旁核、视前内侧核和弓状核GnRH分布的主要核团区,GnRH平均荧光强度显著低于对照组(P<0.05),但胶质细胞的活性增强(P<0.05)。而8月龄免疫大鼠,GnRH神经元分泌量与对照组无显著差异(P>0.05),在GnRH分布的主要核团区,GnRH平均荧光强度显著升高(P<0.05),除视前内侧核区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)平均荧光强度与对照组无显著性差异外(P>0.05),其他核团区则明显升高(P<0.05)。(2)在最后一次加强免疫1个月后血液中CD3+、CD4+细胞比例显著降低(P<0.05),2个月后与对照组无显著性差异(P>0.05);CD8+细胞和T调节细胞则呈先升后降的趋势,至免疫2个月后与对照组差异不显著(P>0.05)。GnRH主动免疫引起胸腺CD3+、CD4+CD8-、T调节细胞和双阳性细胞比例显著升高(P<0.05),CD4-CD8+和双阴性细胞比例显著降低(P<0.05)。(3) GnRH主动免疫显著抑制垂体促性腺激素和睾丸中睾酮的分泌(P<0.05),但胸腺内促性腺激素呈先升后降趋势,GnRH主动免疫至2月龄时显著高于对照组(P<0.05);免疫大鼠胸腺内GnRHR、FSHR、LHR在转录水平和蛋白水平均显著升高(P<0.05),而AR表达则显著被抑制(P<0.05)。GnRH受体拮抗剂在体外可明显抑制胸腺细胞促性腺激素的分泌,但显著升高上清液中GnRH的浓度(P<0.05),也显著促进上述生殖激素受体转录水平的表达(P<0.05)。(4)免疫大鼠血清中Thymulin呈先升后降趋势,在免疫6周时显著高于对照组(P<0.05),但在8周时显著低于对照组(P<0.05);在免疫4~6周时下丘脑内Thymulin显著高于对照组(P<0.05)。免疫大鼠下丘脑内GnRH浓度显著低于对照组(P<0.05)。体外Thymulin对GnRH神经元的分泌活性和胶质细胞的活性及纤维长度均具有显著地的促进作用(P<0.05)。 结论:(1) GnRH主动免疫对18~20d和8月龄大鼠的去势效果不同,对18~20d大鼠的睾丸造成不可逆损伤,睾酮水平处于极低状态,去势效果明显优于8月龄大鼠。GnRH主动免疫对于下丘脑神经元影响因年龄不同而有差异,显著抑制18~20d大鼠下丘脑GnRH神经元分泌活性,增强神经胶质细胞的活性;在8月龄免疫大鼠下丘脑GnRH在其神经元上的表达增强,但分泌活性没有显著变化,而神经胶质细胞活性显著高于对照组大鼠。(2)在最后一次加强免疫1月后,GnRH主动免疫负向调节血液T淋巴细胞,2月后又恢复至正常水平,而在此期间胸腺T淋巴细胞正向选择增强,T淋巴细胞向外周T淋巴细胞池的输送比例加大,为维持和促进机体T淋巴细胞的免疫功能奠定基础。(3) GnRH主动免疫促进胸腺内促性腺激素受体和GnRHR的补偿性表达,同时抑制AR的表达,从而激发胸腺内“促性腺激素一受体”和“GnRH-GnRHR”通路,增强生殖轴上游激素的免疫调节功能,抑制雄激素的免疫抑制功能。(4) GnRH主动免疫抑制胸腺中Thymulin的分泌,但不影响Thymulin在下丘脑的富集。Thymulin在体外促进GnRH神经元的分泌,在体内却不影响其分泌。 创新点:(1)阐明GnRH主动免疫对不同年龄大鼠的不同去势效果及其神经内分泌机制。(2)探明GnRH主动免疫促进免疫系统中枢器官胸腺T淋巴细胞分化成熟的机制。(3)发现胸腺内分泌激素Thymulin对GnRH主动免疫大鼠的下丘脑GnRH神经元的反馈调节作用不明显,但在体外可以促进GnRH神经元和胶质细胞的生长和分泌活性。