蛹虫草高产类胡萝卜素的液体发酵体系建立及其提取方法研究

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蛹虫草是一种珍贵的药用真菌,富含虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、类胡萝卜素等多种生物活性物质,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗癌等多种药理功能。其中类胡萝卜素是近年来在蛹虫草中新发现的一种天然色素,与传统的类胡萝卜素相比具有较强的亲水性,更易被人体吸收,生物利用度更高,具有较高的开发利用价值。蛹虫草类胡萝卜素的合成受到菌株、培养基、培养条件等多种因素的影响,对蛹虫草高效合成类胡萝卜素的液体发酵培养条件的研究尚未见报道。因此,本文对高产类胡萝卜素的蛹虫草菌株、培养基、培养条件进行了系统研究,旨在建立一套蛹虫草高产类胡萝卜素的液体发酵培养体系,同时对蛹虫草类胡萝卜素的种类进行了鉴定。本文的主要研究结果如下:(1)筛选出高产类胡萝卜素的液体发酵菌株。以类胡萝卜素含量为指标,对13株蛹虫草菌株进行了筛选,结果表明CM-03、CM-04和CM-11三株菌株高产类胡萝卜素,作为液体发酵的菌种。(2)优化了蛹虫草液体发酵培养基配方。以大米、小麦、玉米、麸皮和大豆为培养基质,根据蛹虫草营养特性设计了培养基配方,比较CM-03、CM-04和CM-11三株菌株分别在不同谷物培养基下的类胡萝卜素产量情况,结果发现蛹虫草菌株CM-03最佳液体发酵培养基配方为1.4g·L-1小麦、2.8 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆;蛹虫草菌株CM-04最佳液体发酵培养基为1.2 g·L-1大米、0.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆;蛹虫草菌株CM-11最佳液体发酵培养基为1.7 g·L-1小麦、2.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆。结果表明不同菌株其高产类胡萝卜素的培养基不同。(3)优化了两种蛹虫草液体发酵方法的条件。选取蛹虫草菌株CM-04为发酵菌株,以类胡萝卜素含量为指标,通过单因素实验、响应面设计对蛹虫草的液体发酵条件进行了优化。结果表明摇瓶发酵法的最佳条件为黑暗摇瓶培养5 d,光照摇瓶培养6d,最高产量达到662.9±48.4μg/g。两步法发酵的最佳条件为黑暗摇瓶培养4 d,光照静置培养10 d,平板倒入量100mL,获得最高产量为1217.5±115.9μg/g。两步法发酵的放大实验获得的最高产量为1839.2±145.9μg/g。(4)在摇瓶发酵法的基础上,研究了非生物诱导物(金属离子)和生物诱导物(番茄汁、花生油、壳聚糖、粘红酵母激发子)对蛹虫草类胡萝卜素产量的影响。结果表明Na+、番茄汁和粘红酵母激发子对蛹虫草类胡萝卜素的产量无显著影响,Ca2+、Fe2+、Mn2+和Zn2+四种金属离子和花生油会显著抑制类胡萝卜素的合成,只有浓度4mg/mL添加量达到2 mL的壳聚糖对类胡萝卜素的含量有促进作用,相较于对照组,类胡萝卜素含量提高了24.2%。(5)建立了蛹虫草摇瓶发酵过程中菌丝生长和产物合成的动力学模型。研究结果表明,菌丝生长的动力学方程为:dx/dt=0.09947(1-X/(7.602)X,类胡萝卜素合成的动力学方程为:dp/dt=0.5857X。(6)建立了安全的蛹虫草类胡萝卜素提取工艺。结果表明乙醇提取法的最佳工艺条件为:采用石英砂研磨破壁,乙醇浓度60%,料液比1:40,水浴提取温度80℃,提取级数为2级;水提法的最佳工艺条件为:取新鲜子实体,料液比1:20,100℃沸水浴提取,提取级数为2级。(7)通过HPLC-MS研究了蛹虫草类胡萝卜素的种类。结果共发现了10种物质,其相对分子质量分别为:512、526、496、498、510、524、494、508、522和536。蛹虫草类胡萝卜素中并未发现已报道的叶黄素和玉米黄素,虽然有四种物质的相对分子质量与北虫草黄素能够匹配,但结构存疑,同时还发现了其它6种未被报道的物质。
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