论文部分内容阅读
【目的】枳壳为常用理气药,味苦、辛、酸,具有理气宽中,行滞消胀的功效,临床常用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛等。凤眼片枳壳是樟树帮特色炮制饮片之一,前期研究表明,凤眼片枳壳生品燥性弱于药典法枳壳生品,传统认为,麸炒能缓和枳壳燥性,那么麸炒是否也能进一步缓和凤眼片枳壳生品燥性,目前尚未可知。本实验拟通过比较凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳对正常小鼠的津液影响,比较凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳的醇提物化学成分,找寻出引起燥性改变的主要成分,并通过整体动物实验与细胞实验进行验证,初步阐明麸炒对凤眼片枳壳燥性影响的作用机制。【方法与结果】(1)以正常小鼠为研究对象,研究凤眼片枳壳生品(凤眼片枳壳)与麸炒凤眼片枳壳对正常小鼠津液的影响。首先以饮水变化量、小鼠尿量、全血黏度作为外在观测指标,同时计算颌下腺指数,观察颌下腺病理切片状态,采用ELISA法对小鼠肾脏AQP2水平进行测定,q RT-PCR技术检测小鼠肾脏AQP2 m RNA表达,Western blot技术检测小鼠颌下腺AQP5的蛋白表达。结果发现,与药典法枳壳生品组(枳壳组)相比,凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳均能有效降低小鼠给药期间的饮水变化量、小鼠尿量,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);颌下腺指数结果显示,枳壳组小鼠颌下腺呈萎缩状态,整体上颌下腺指数偏小;病理切片结果显示枳壳组腺泡萎缩明显,导管皱缩,与正常组存在明显差异,而凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳组更趋向于正常组;ELISA法对小鼠肾脏AQP2水平检测结果显示,与枳壳组相比,凤眼片枳壳高剂量组的小鼠肾脏中AQP2含量极显著升高(P<0.01),麸炒凤眼片枳壳高剂量组显著性升高(P<0.05)。q RT-PCR技术检测肾脏AQP2表达结果显示,与枳壳组相比,凤眼片枳壳低剂量组AQP2 m RNA极显著性升高(P<0.01),另外,凤眼片枳壳高、中剂量组亦都呈现上升趋势。Western blot技术检测小鼠颌下腺AQP5的蛋白表达结果显示,与枳壳组相比,除凤眼片枳壳中剂量组外,其余各给药组均极显著性升高(P<0.01)。综合各项指标结果显示,凤眼片枳壳和麸炒凤眼片枳壳对正常小鼠津液的损伤作用均弱于枳壳组,其中,凤眼片枳壳组弱于麸炒凤眼片枳壳组。(2)运用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术,对凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳醇提物进行分析,采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)等分析方法,以VIP>1.5,P<0.05作为筛选条件,筛选得到差异成分;在定性的基础上,采用UPLC法对差异成分进行定量分析。结果在正离子模式下共鉴定出43个化合物,其中凤眼片枳壳43个,麸炒凤眼片枳壳41个,鉴定得到成分中,黄酮类33个,香豆素6个,柠檬苦素2个,其他类成分2个;通过借助PCA和OPLS-DA等分析方法,根据VIP>1.5的原则定性找寻凤眼片枳壳与麸炒凤眼片枳壳中的差异成分,得到凤眼片枳壳麸炒前后9个差异性成分,以VIP>1.5,P<0.05作为筛选条件,筛选得到差异成分5-去甲川陈皮素。采用UPLC法对5-去甲川陈皮素定量分析结果显示凤眼片枳壳和麸炒凤眼片枳壳中5-去甲川陈皮素的含量均低于药典法枳壳生品,凤眼片枳壳中5-去甲川陈皮素含量低于麸炒凤眼片枳壳组,推测5-去甲川陈皮素可能是引起凤眼片枳壳和麸炒凤眼片枳壳津液损伤差异的成分之一。(3)以正常小鼠为整体动物实验研究对象,以饮水变化量、唾液流率、全血黏度、q RT-PCR及Western blot技术检测的小鼠颌下腺AQP5、AQP5 m RNA表达等为考察指标,对5-去甲川陈皮素的燥性进行整体动物验证;借助Auto Dock Tools 1.5.6、Auto Dock Vina 1.1.2、PYmol 2.5.0等软件对5-去甲川陈皮素与AQP5进行对接预测,从分子对接角度进行5-去甲川陈皮素的燥性验证;采用HSG细胞为研究对象,以AQP5、AQP5 m RNA表达等为考察指标,对5-去甲川陈皮素的燥性进行细胞验证。整体动物实验结果显示,与枳壳组相比,5-去甲川陈皮素组饮水变化量极显著性升高(P<0.01),与空白组相比,枳壳组、5-去甲川陈皮素组唾液流率都呈现不同程度的下降趋势,该差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与空白组相比,枳壳组、5-去甲川陈皮素组的全血黏度低、中、高切值都不同程度地上升,该差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01),将枳壳组和5-去甲川陈皮素组进行比较,5-去甲川陈皮素组的全血黏度值更高;颌下腺指数的结果显示,与空白组相比,枳壳组颌下腺指数显著性下降(P<0.05),5-去甲川陈皮素组极显著性下降(P<0.01);颌下腺q RT-PCR及Western blot结果显示,5-去甲川陈皮素对小鼠颌下腺AQP5表达呈下调趋势。分子对接结果显示,5-去甲川陈皮素与AQP5中氨基酸残基精氨酸ARG-153、苏氨酸THR-150、天冬酰胺ASN-228、谷氨酰胺GLN-81处形成氢键作用,增加了5-去甲川陈皮素与AQP5的结合。对接结果显示最佳构象与AQP5结合能为:-7.1 kcal/mol,提示5-去甲川陈皮素具有与AQP5结合的特殊结构。HSG细胞实验结果显示,5-去甲川陈皮素能够极显著性下调HSG细胞中AQP5 m RNA表达(P<0.01),同时也可以极显著性下调HSG细胞中AQP5表达(P<0.01)。【结论】凤眼片枳壳麸炒前后整体动物实验对比结果显示,麸炒凤眼片枳壳燥性强于凤眼片枳壳,UPLC-Q-TOF-MS/MS成分定性分析显示,5-去甲川陈皮素是凤眼片枳壳麸炒前后差异成分主要成分之一,UPLC定量分析结果显示,麸炒凤眼片枳壳5-去甲川陈皮素含量高于凤眼片枳壳,正常小鼠整体动物实验、HSG细胞实验等验证实验结果均显示5-去甲川陈皮素是影响凤眼片枳壳麸炒前后燥性差异的主要成分之一,研究结果为麸炒对凤眼片枳壳燥性的影响及作用机制阐明提供了一定科学依据,为凤眼片枳壳的传承创新发展提供参考。