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目的探讨靶序列富集多重PCR在儿童肺炎多种细菌性病原联合检测中的临床应用价值,了解本地区儿童肺炎的细菌性病原分布,期望建立针对儿童肺炎常见细菌性病原快速、敏感、特异的诊断方法,指导临床进行肺炎的病因学诊断并合理使用抗生素。方法确诊为社区获得性肺炎的患儿188例,在入院当天采集深部呼吸道吸引物,用普通培养基和肺炎链球菌、流感嗜血杆菌选择性培养基进行细菌培养,然后提取深部呼吸道吸引物中病原体的DNA,采用荧光定量单PCR的方法检测肺炎支原体,并对同一标本采用靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)技术同时扩增肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、化脓链球菌、粪肠球菌及屎肠球菌14种呼吸道病原菌和肺炎支原体的靶基因,扩增产物用Luminex100多功能悬浮点阵仪检测。以培养和单PCR为参考,比较Tem-PCR对细菌和肺炎支原体检测的敏感性和特异性;分析细菌培养和病原特异性DNA联合检测对肺炎细菌学病原的影响以及肺炎支原体与细菌混合感染的情况。结果(1)在188例呼吸道标本中,细菌培养共分离出114株病原菌,其中3例同时培养出2种病原菌,这些病原菌分别是流感嗜血杆菌24株,大肠杆菌16株,粘质沙雷菌14株,肺炎克雷伯菌12株,副流感嗜血杆菌11株,金黄色葡萄球菌9株,肺炎链球菌7株,铜绿假单胞菌3株,鲍曼氏不动杆菌2株,阴沟肠杆菌2株,其他少见细菌9种共14株,培养的阳性率为59.1%(111/188)。(2)经Tem-PCR技术扩增后,188例标本在Luminex100多功能悬浮点阵仪中有75例呈阳性,共检测出93株病原菌的靶基因,分别是流感嗜血杆菌40株,肺炎链球菌36株,鲍曼氏不动杆菌10株,铜绿假单胞菌4株,金黄色葡萄球菌3株,另外9种Tem-PCR已设计的细菌包括肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌等均未检出,Tem-PCR的阳性率是39.9%(75/188)。(3)以细菌培养作为参考标准,Tem-PCR对14种病原菌总的敏感性为51.0%,特异性为68.0%,符合率为58.3%,对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼氏不动杆菌、铜绿假单胞菌的敏感性分别为100%、41.7%、11.1%、50.0%、66.7%,特异性分别为84.0%、81.7%、98.9%、95.2%、98.9%。Tem-PCR对肺炎链球菌的检出率36/188(19.1%)明显高于培养7/188(3.7%),P＜0.01;对流感嗜血杆菌的检出率40/188(21.3%)与培养24/188(12.8%)之间无明显差异,P＞0.05。(4)以细菌培养或Tem-PCR任一阳性为标准,联合检测对细菌性病原的总检出率为78.2%(147/188),依次是流感嗜血杆菌36.7%(54/147)、肺炎链球菌24.5%(36/147)、大肠杆菌10.9%(16/147)、肺炎克雷伯菌8.2%(12/147)、金黄色葡萄球菌7.5%(11/147)、鲍曼氏不动杆菌7.5%(11/147)、绿脓杆菌3.4%(5/147)和阴沟肠杆菌1.4%(2/147)。联合检测能提高流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和鲍曼氏不动杆菌的检出例数。(5)在这188例呼吸道标本中,荧光定量单PCR共检出80例肺炎支原体阳性标本,阳性率为42.6%(80/188);Tem-PCR检出51例肺炎支原体阳性标本,阳性率为27.1%(51/188),两者之间无显著差异,P＞0.05;以荧光定量单PCR为参考标准,Tem-PCR对肺炎支原体的敏感性、特异性、符合率分别为30.0%、75.0%、55.9%。(6)以Tem-PCR检测结果为准,肺炎支原体与细菌的混合感染共16例,混合感染率为8.5%(16/188),其中最常见的是肺炎支原体与流感嗜血杆菌的混合感染,共有8例,占混合感染的50.0%(8/16)。结论靶序列富集多重PCR技术对肺炎链球菌有很高的敏感性,但对其他细菌和肺炎支原体还有待改进。细菌培养和病原特异性DNA联合检测应用能显著提高儿童肺炎细菌性病原的检出率,可能更真实地反映肺炎的细菌病原学情况。应用靶序列富集多重PCR技术可以及时明确CAP病原中肺炎支原体与细菌的混合感染。