研究背景和目的胎儿酒精综合症是早期酒精暴露引起的最严重的症状之一,这些症状包括面部缺陷,心包肿大,和严重的认知和行为缺陷。在加拿大和美国1%的儿童被诊断为胎儿酒精综合症。胚胎期的酒精接触,会影响胎儿的神经系统发育,特别是对发育中神经元、神经胶质细胞的影响,尽管有文献报道,但是具体机制并不清楚。基于酒精对胎儿的影响如此严重,所以我们想探索一下酒精对胎儿的影响。动物模型的选择对于胎儿酒精综合症的研究至关重要,相比较而言,斑马鱼比其他哺乳动物模型更有优势。斑马鱼胚胎是在体外产卵,从而允许我们更加精确的控制添加酒精的浓度和接触时间。与哺乳动物相比,斑马鱼胚胎的整个发育过程在体外,使斑马鱼的神经系统发育过程易于观察和记录。斑马鱼作为实验动物的另一个优点是高产卵量。一对雌雄一周可以交配一次,并且一次可以产100-200个鱼卵,并且研究周期较短。最重要的是斑马鱼胚胎暴露于酒精中表现出与胎儿酒精综合征的小孩相似的表型,这些优点都是其他动物模型不可替代的,并且斑马鱼作为一种实验动物已经逐渐被广泛认可。因此,我们选择了斑马鱼作为实验动物模型。在斑马鱼胚胎及大脑发育过程中,Notch信号通路至关重要,而且这个信号通路从斑马鱼到人的进化链条中高度保守。它不仅控制着细胞的增殖和分化,还与神经元的发育密切相关。斑马鱼中的Notch信号通路是通过Notch信号受体和它的标准配体Delta和Serrate(在哺乳动物中叫JAGGED)相互作用,然后通过r-分泌酶分解释放的Notch胞内片段(NICD)所激活的。Notch胞内片段进入胞核内并且与DNA结合蛋白CSL(CBF/RBP-J,Su(H),LAG-1/CSL)相互作用,从而导致靶基因Hairy a和Enhancer-of-split[Hairy/E(spl)]的转录,从而产生相应的生物学效应,如抑制神经元的表达和神经的发生,进而影响斑马鱼的神经发育。而notch信号的阻断剂氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)能够有效阻断γ-分泌酶的作用,从而有效的阻止Notch信号的激活。所以本实验采用DAPT来阻断Notch信号在斑马鱼神经发育过程中的作用。我们首先观察了酒精对斑马鱼胚胎神经发育的影响,然后研究了酒精对Notch信号通路表达水平的影响。为进一步明确Notch信号的作用,我们采用Notch阻断剂,将Notch信号阻断后,观察酒精对神经系统发育的影响,并比较了同浓度的酒精加不同浓度Notch信号抑制剂情况下,酒精对神经元的作用,旨在明确探讨酒精通过Notch信号通路影响斑马鱼胚胎的神经发育。为进一步研究酒精作用的具体机制,我们选择了神经胶质成熟因子作为指标,胶质细胞成熟因子是由142个氨基酸残基组成的分子量为17kDa的蛋白质小分子,主要包括胶质成熟因子-β(GMFB)和胶质成熟因子-γ(GMFG)。GMFB主要表达于脊椎动物的大脑中,胸腺和小肠中,有报道GMFB基因与发育相关,但是具体的机制,特别是该基因的功能还不清楚。因此,我们观察酒精作用后,对GMFB基因表达情况的影响,并且研究了 GMFB在斑马鱼发育过程中的时空表达特点以及构建GMFB基因敲除模型,再观察敲除GMFB基因后对斑马鱼的表型变化以及对斑马鱼神经系统和血液系统的变化,同时用RNA-seq技术分析斑马鱼胚胎的基因表达谱的改变。本研究分为三个部分:第4部分酒精能够减少斑马鱼的神经祖细胞并抑制其神经元和神经胶质细胞的分化一.实验目的本文主要研究不同浓度的酒精(1%,2%和2.5%)对斑马鱼的神经祖细胞,神经元和神经胶质细胞的影响。探究它可能的分子机制,从而更加清楚的了解酒精对斑马鱼神经发育的影响。二.实验方法1.斑马鱼的饲养和酒精处理斑马鱼的饲养按照标准方法来进行。斑马鱼的分期按照体节数(somites).受精后小时(hpf)和受精后天数(dpf)来区分。对于一对雌雄鱼产的鱼卵,随机分为四组,分别是对照组,1%,2%,和2.5%酒精组。酒精是溶解在系统水中的,百分比代表的是酒精和系统水的体积比。处理区间是5-24h,在受精后24小时换成系统水。2.探针制备设计探针引物,构建不同标记物的探针,并以原位杂交验证探针的有效性3.原位杂交神经祖细胞的标志物是sox2.原神经基因的标志物neurogenin1.有丝分裂后神经元的标志物是Huc,早期神经胶质细胞的标志物slc1a3a.成熟神经胶质细胞的标志物是myelin-associated glycoprotein(mag)的标志物。构建不同标志物的探针来检测相应细胞的变化。4.实时定量pcr的方法针对神经发育不同阶段细胞的标志物设计相应的引物来检测不同细胞的变化情况三.实验结果1.不同浓度的酒精处理后斑马鱼胚胎死亡率和一些形态学的改变随着酒精浓度的增加,4天的小鱼的死亡率逐渐增加,并且当酒精浓度大于2%时,胚胎的死亡率显著增加。随着酒精浓度的增加,鱼卵的孵化率和心率显著降低,畸形率显著增加。另外,当酒精浓度大于1.5%时,一些畸形如心包肿大,血流减慢甚至血流停滞出现。2.酒精可以减少神经祖细胞的数量在75%外包期时,原位杂交结果显示酒精暴露3.5小时后sox2的表达轻微的降低。酒精对神经发育的抑制强度随着酒精浓度的增加而增加。并且qPCR分析也证实了 sox2表达的降低。观察受精后24小时的小鱼中sox2的表达,发现酒精处理组高于对照组,并且qPCR结果也证实了上述结论3.酒精暴露抑制神经元的分化随着酒精浓度的增加,神经元的表达逐渐减少。4.酒精暴露抑制神经胶质细胞的分化随着酒精浓度的增加,成熟神经胶质细胞的表达显著减少。而早期的神经胶质细胞标志物的表达随着酒精浓度的增加在尾部减少,而在头部增加。四.实验结论酒精可以导致斑马鱼神经祖细胞,神经元和胶质细胞减少,并抑制神经元和神经胶质细胞的分化。第二部分酒精通过Notch信号通路影响斑马鱼胚胎的神经发育一、实验目的酒精可以抑制斑马鱼的神经发育,而Notch信号对斑马鱼的神经发育起着重要作用。我们想知道酒精是否对Notch信号有影响,并是否可以通过上述信号来斑马鱼胚胎的神经发育。二.实验方法1.斑马鱼的饲养斑马鱼的饲养温度是28.5℃,白天和黑夜的比例是14:10,鱼的繁殖根据标准方法进行。2.酒精和药物处理酒精、DAPT和环巴胺的处理时间是5-24hpf。DAPT储液溶解在系统水中,终浓度是100μM。对照组用DMSO代替药物,黑色素的产生通过在24hpf时向系统水中加0.003%PTU来抑制。3.原位杂交构建不同标志物的探针来检测相应细胞的变化。4.实时定量PCR针对不同的标志物设计相应的引物来检测不同细胞的变化情况三.实验结果1、1.5%的酒精处理斑马鱼胚胎可以上调Notch信号通路用1.5%的酒精处理斑马鱼胚胎,测Notch信号通路的有关基因,它们的表达是增加的。2、抑制Notch可以促进斑马鱼的神经发育用DAPT抑制Notch信号后,斑马鱼神经发育各阶段的细胞是上调的。抑制Notch信号可以使斑马鱼的神经祖细胞提前分化并促进神经祖细胞的分化。在不同的时间点,用原位杂交技术测斑马鱼的神经祖细胞,原神经基因元和神经元的表达情况,发现抑制Notch信号后可以使斑马鱼的神经祖细胞提前分化并促进神经祖细胞的分化。3、1.5%的酒精与不同浓度的notch信号抑制剂DAPT对斑马鱼神经元(HUC)表达的影响随着notch信号抑制剂的增加,斑马鱼神经元(HUC)的数量是增加的。四.实验结论酒精可以上调Notch信号,并通过Notch信号通路来影响斑马鱼胚胎的神经发育。第三部分酒精对GMFB基因的影响及敲除GMFB基因对斑马鱼发育的影响一.实验目的1、酒精对GMFB基因的影响2.敲除GMFB斑马鱼模型的建立与验证3.敲除GMFB后,观察斑马鱼的血液系统中性粒细胞和小巨噬细胞的变化。4.GMFB敲除后基因表达谱的改变。二.实验方法1.原位杂交制备GMFB探针验证GMFB的敲除效果2.苏丹黑B染色为了观察敲除GMFB后对斑马鱼中性粒细胞的影响3.中性红染色观察GMFB在对斑马鱼小巨噬细胞的变化4.Western 从蛋白水平验证GMFB是否敲除成功5.RT-PCR 我们想从mRNA水平观察基因表达水平的变化三.实验结果1.酒精对GMFB基因的影响酒精处理后,GMFB基因的变化没有统计学差异。2.GMFB的时空表达原位杂交结果显示GMFB在3h开始表达并且在全身都有表达,3天后却只在头部有表达。Western结果显示GMFB蛋白在2天到3天达到最高,3天以后,GMFB的表达逐渐降低。3.western和原位杂交检测GMFB基因敲除成功原位杂交和western结果都显示GMFB敲除成功。4.敲除GMFB基因对斑马鱼神经元和神经胶质细胞的影响结果显示是无统计学差异的。5.GMFB纯合子,GMFB杂合子和AB型斑马鱼的苏丹黑B染色苏丹黑B染色变化主要是代表中性粒细胞的变化,我们使两个杂合子进行杂交,那么得到的鱼卵为四分子一纯合子,四分之一为AB,二分之一为杂合子。由于它们的公鱼和母鱼是相同的,所以得到的结果更加有可信性。但是这三个组分别做了30条鱼,结果是这三组没有统计学差异(结果重复了三次)。。6.GMFB纯合子,GMFB杂合子和AB型斑马鱼的中性红染色中性红染色的变化可以代表小巨噬细胞的变化,我们做中性红染色来检测敲除GMFB基因对斑马鱼的小巨噬细胞的变化,结果经过统计学分析是没差异的。所以不能说明敲除GMFB基因对斑马鱼的小巨噬细胞是有变化。7.敲除GMFB对斑马鱼基因表达谱的影响RNA-seq分析结果显示总共有33个基因有变化,有9个基因是上调的,有24个基因是下调的。四.实验结论本实验通过在蛋白水平和mRNA水平检测斑马鱼胚胎的GMFB基因的表达情况,证实已经在斑马鱼上成功的敲除GMFB基因。敲除GMFB基因对斑马鱼的中性粒细胞和小胶质细胞的数量是无影响的。