研究背景肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是指从左右肝管汇合部（肝门部胆管）以上至肝内末梢胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤,也称为末梢型胆管癌。近年来,临床上ICC的发病率和死亡率均有所上升。随着诊疗技术的不断进步,过去几十年间ICC的1年生存率明显提高,而5年生存率并无显著性改善（小于5%）。肝内胆管癌唯一有望获得治愈的方法是根治性外科切除。但是多数ICC患者在初次就诊时已出现肿瘤转移的情况,从而失去了根治性手术切除的机会;并且ICC恶性程度较高,即使行根治性切除术后肿瘤复发、转移发生率仍偏高,因此ICC患者手术效果不佳、总体预后差,仍是临床工作中经常遇到的难题。此外肝内胆管癌行放化疗效果差,且早期缺乏特征性临床表现,目前仍缺乏有效的治愈方法,且疾病早期缺乏特异性的预警标记物。因此,在肝内胆管癌的临床和基础研究中,寻找特异性较强、表达丰度较高的肿瘤分子标记物,并以此作为潜在的治疗靶点,提高分子靶向治疗的敏感性和特异性,具有重要的基础研究和临床潜在应用价值。Let-7 microRNA是最早发现的mi RNA之一,大量研究证实Let-7 microRNA与人类多种癌症的发生、发展密切相关。IL-6（interleukin-6,白细胞介素-6）是一种具有多种功能的生物活性多肽物质,近年来发现其在肿瘤的发生和发展过程中起重要的调节作用,它可直接或间接抑制某些肿瘤生长,也能对某些肿瘤的生长起到促进作用。IL-6和EGF（Epidermal growth factor,表皮细胞生长因子）等肿瘤相关生长因子都可以激活信号传导和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）,在肿瘤发生发展过程中发挥作用。信号传导和转录激活因子3（STAT3）在体内分布广泛,是一种重要的癌基因,也是肿瘤相关炎症调控通路的重要组成部分,STAT3可以被磷酸化活化,激活的STAT3参与胞浆内的细胞信号向细胞核传递,进一步介导下游靶基因的转录,从而在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起重要的调节作用。前期的文献分析发现:STAT3表达水平和活性与多发型骨髓瘤、肺癌、肝细胞型肝癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤等密切相关,且STAT3激活水平与肿瘤预后密切相关。前期的文献提示:胆管内炎性微环境在胆管癌发生、发展过程中起着重要的调控作用,而STAT3正是上述炎性调控网络中的关键节点,在信号转导过程中STAT3主要以磷酸化的方式被活化,同时可以通过转录后调控的方式来影响STAT3的表达和活化,具备这种转录后调控功能的主要分子为microRNA。通过mi Randa软件分析发现:能够直接靶向STAT3 3’UTR的microRNA大约有122项,其中包括前期文献所报道的Let-7 microRNA家族。然而,肿瘤相关炎症网络中重要因子（Let-7 microRNA家族、IL-6、STAT3）在肝内胆管癌进展中的功能以及其与临床病理参数、疾病预后之间的关系目前仍不明确,值得我们进一步研究证实。实验方法:1.采用real-time PCR、western blot和IHC等方法检测肝内胆管癌和癌旁组织中STAT3和Let-7a/b表达情况;2.结合临床病理资料分析STAT3与相关临床参数及预后之间的关系;我院肝胆外科从2006年1月到2008年12月期间,行根治性手术切除的肝内胆管癌患者61例,均具备完善的病例资料和随访数据,选取标本,制作组织芯片;采用免疫组化法检测ICC和癌旁组织芯片标本中STAT3的表达情况,结合临床病例资料分析STAT3表达量与ICC临床参数（年龄、性别、肿瘤数目、肿瘤直径、合并基础疾病、淋巴转移、血管侵犯、肿瘤分化程度等）和远期生存情况（无瘤生存时间和总体生存时间等）的关系。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。应用Fisher精确检验和Pearson卡方检验分析STAT3表达量与临床病理参数之间的关系。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,对比采用log-rank检测。采用Cox回归模型分析临床参数和STAT3表达水平对患者总体生存率和无瘤生存期的影响。P＜0.05认为存在显著性统计差异。3.构建STAT3过表达及si RNA质粒,并转染HUCCT1及RBE细胞株,鉴定转染效果;构建ov-STAT3慢病毒并感染RBE细胞,获得STAT3稳定过表达的RBE细胞株,Matrigel和Transwell方法检测STAT3高低表达细胞株的迁移及侵袭能力。4.采用CCK-8方法分析STAT3高低表达对HUCCT1及RBE细胞系增殖能力的影响;5.扩增STAT3稳定过表达的RBE细胞系并行裸鼠皮下荷瘤,观察肿瘤生长情况。6.建立了Let7b过表达和干扰的胆管癌细胞系,检测细胞系中STAT3的表达水平,Transwell和Matrigel实验进一步证实Let7b对胆管癌细胞侵袭、转移的作用。加入外源IL-6后观察Let7b对STAT3表达水平调节作用的变化,以及对胆管癌细胞侵袭、转移能力的影响。实验结果:1.STAT3在ICC肿瘤组织标本中表达显著性升高免疫组化结果显示:在61例ICC组织内有44例呈阳性表达,STAT3阳性表达率为72.1%;在61例癌旁组织内有11例呈阳性表达,阳性表达率为18.0%,两组之间存在显著性表达差异（P＜0.05）。61对肝内胆管癌和癌旁组织,进一步检测STAT3m RNA表达水平,其中50对癌组织中STAT3 m RNA表达水平高于癌旁组织（50/61,82%）,存在显著性差异（P＜0.01）。2.STAT3表达水平对ICC预后的影响将ICC的各项临床病理参数和患者的总体生存期、无瘤生存期进行单因素分析,结果提示:肿瘤直径、合并肝硬化、病理性卫星灶和STAT3表达水平和ICC患者总体生存期之间存在显著相关性;而ALB（白蛋白）、AFP（甲胎蛋白）、微血管侵犯、肿瘤直径、STAT3表达水平和无瘤生存期之间存在显著相关性。COX多因素分析提示:STAT3表达水平和肿瘤直径是影响ICC患者总体生存期的两项独立危险因素;而ALB、微血管侵犯、肿瘤直径和STAT3表达水平是影响无瘤生存期的独立危险因素。高表达STAT3的ICC与低表达STAT3组相比,患者的总体生存期和无瘤生存期均显著性缩短,临床预后更差。3.STAT3表达与临床参数之间的关系根据肿瘤内STAT3的表达水平,分为高表达组和低表达组,根据分组情况分析其与ICC临床参数间的关系,发现STAT3高表达与肿瘤直径较大、合并子灶、血管受侵犯、淋巴结转移和肿瘤分化差存在正相关。由于淋巴结转移与肝内胆管癌术后肿瘤复发存在密切的相关性,为了进一步确认STAT3表达与ICC转移之间的关系,在病理明确伴有淋巴结转移的15例患者中,检测ICC肿瘤灶与淋巴结转移灶内的STAT3表达水平,发现这15例患者均属于STAT3高表达组,并且在大部分患者（9/15）中淋巴结转移灶内STAT3表达比肿瘤原发病灶更高,提示STAT3高表达预示着ICC临床发生淋巴结转移的可能性更大。4.过表达STAT3增加ICC细胞的转移潜能为了探讨STAT3表达与胆管癌转移能力的关系,我们建立了以pc DNA3.1为载体的STAT3过表达质粒。在胆管癌细胞系RBE和HUCCT1中瞬时转入过表达STAT3的质粒pc DNA-STAT3和pc DNA3.1空载体内,划痕和transwell实验发现过表达STAT3的RBE和HUCCT1细胞迁移能力要高于对照细胞,提示STAT3过表达可以促进ICC细胞转移能力。5.过表达STAT3通过激活STAT3磷酸化来增加ICC细胞的增殖能力过表达STAT3的胆管癌细胞内STAT3磷酸化水平显著性升高,过表达STAT3的胆管癌细胞增殖能力显著高于对照细胞株（P＜0.01）;在裸鼠皮下注射过表达STAT3的胆管癌细胞,其肿瘤体积比对照组显著性增大（P＜0.01）。6.检测61例胆管癌患者癌/癌旁组织中Let-7a/b表达水平,我们发现胆管癌患者癌中Let7a/b表达量均显著低于癌旁（P＜0.05）,Let7b表达量在癌/癌旁中差异性更明显（P＜0.001）。7.建立Let7b过表达和干扰的胆管癌细胞系,通过检测细胞系中STAT3的表达水平发现:Let7b过表达显著抑制胆管癌细胞系中STAT3表达,抑制Let7b后胆管癌细胞系中STAT3表达上调,外源IL-6可抵消部分Let7b过表达对STAT3的下调作用,提示在胆管癌细胞中Let7b的作用是通过调节STAT3的表达来实现。8.Transwell和Matrigel实验也证实胆管癌细胞中Let7b的低表达能够通过促进IL-6表达间接促进,或者直接促进STAT3的高表达,从而导致转移相关基因的升高,促进胆管癌的侵袭、转移。结论:STAT3表达水平和ICC患者恶性程度存在相关性,STAT3高表达与ICC恶性程度较高（肿瘤直径大、病理性卫星灶、伴有血管侵犯、淋巴结转移和肿瘤分化差）存在正相关性。高STAT3表达预示着肿瘤恶性程度高和淋巴结转移潜能大,预后差。进一步体内和体外实验表明:过表达STAT3的胆管癌细胞迁移能力要高于对照细胞,提示STAT3过表达促进ICC细胞的转移潜能。Let7b的低表达能够通过促进IL-6表达间接,和直接促进STAT3的高表达,从而促进了胆管癌的侵袭、转移,造成预后较差。该研究提示了STAT3在肝内胆管癌中可以作为一个预测预后的分子标志和潜在的分子治疗靶点。