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戊型肝炎(HE)是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引发的传染性疾病,全球每年大约有2000万的HEV感染者和330万的急性患者,死亡人数约56600人。HEV有4种基因型和1种血清型,其中基因1、2型仅感染人,主要流行于发展中国家;基因3、4型既能感染人也能感染动物,主要流行于发达国家。近年来HEV在中国主要以基因4型流行为主。预防人感染HEV病毒是目前防治该疾病的最有效方法。在我国,已有两种重组蛋白疫苗进行了临床试验,其中一种疫苗益可宁—Hecolin已进行商业化生产。由于HE有一定的自限性,所以在一些疾病流行和散发地区,HEV疫苗并没有被列入该国家强制免疫规划中。因此我们转变思路,把HEV的预防的重点转移到非人类宿主上。猪是我国基因4型HEV最主要的宿主来源,因此对猪接种HEV疫苗可以从源头上减少4型HEV,并有可能达到彻底根除4型HEV感染人类的目的。HEV疫苗的收益/成本比值在猪养殖业是非常有吸引力的,而HEV和口蹄疫病毒(FMDV)的二价重组疫苗将具备针对这两种病毒的双重保护,因此相对于单独HEV疫苗,二价疫苗将有更高的收益/成本比。FMDV是口蹄疫疾病的病原体,该病毒在偶蹄类动物中具有高度传染性,可引起猪养殖业的巨大经济损失。FMDV疫苗是目前控制FMD爆发的常用方法,在我国属于国家强制免疫范围。因此我们将FMDV与HEV联合,设计出的二价重组疫苗能够达到一举多得的效果。为了开发HEV-FMDV二价疫苗,我们的研究如下生物信息学分析和HEV-FMDV嵌合蛋白优化选择方法:为开发HEV-FMDV联合疫苗,我们首先选择HEV基因4型ORF2里的4个片段:p166(aa 452-617),p179(aa 439-617),p216(aa 420-637)和p222(aa 439-660),并且已经研究了这4个蛋白片段的抗原性和免疫原性。然后,我们设计FMDV相关的包含三个免疫显性表位VP1 G-H环的抗原—seq8,它们分别来自于O型FMDV的三个不同拓扑型:O/Mya/98(东南亚型),O/HN/CHA/93(Cathay型)和 O/IRN/2010(泛亚2型)。之后,我们将seq8分别连接到4个HEV片段的N端或C端,设计出一系列联合蛋白。我们将所有候选蛋白都进行了3D结构模型预测与精确化、不同模型HEV和FMDV关键抗原表位突出的预测、抗原表位突出情况对比及最佳联合蛋白的挑选和HEV-FMDV候选疫苗进行弹性分析。结果与讨论:预测所有HEV-FMDV联合蛋白的3D结构,从中选择最优蛋白作进一步研究分析。结构特征分析表明:seq8连接在HEV蛋白的N端对HEV和FMDV的关键抗原表位突出基本没有影响,更具体的说,Seq8-P216和Seq8-P222的抗原性最为保守并且其关键抗原表位更为突出,因此我们选择这两个蛋白进行弹性分析。分子动力学表明:水溶液中Seq8-P216比Seq8-P222有更好的柔韧性,与此同时,Seq8-P222在水溶液中的变动对关键抗原表位氨基酸的影响最小,其在大多数构象中突出增加。结论:我们的计算分析表明:将FMDV Seq8抗原连接到HEV P216和P222片段的N端,保留住了HEV和FMDV的关键抗原表位。因此我们选择表达Seq8-P216和Seq8-P222这两种联合蛋白,并通过一系列实验评估两个蛋白的抗原性和免疫原性。HEV-FMDV联合蛋白表达、纯化和特征描述方法:评估已选HEV-FMDV联合蛋白在大肠杆菌中的表达能力,可溶性,热稳定性和病毒样颗粒的组装。我们根据大肠杆菌常见密码子合成FMDV Seq8,HEV目的基因从HEV ORF2编码的DNA中扩增(基因4型HEV,NJ-703病毒株,GenBank No:AY789228)。通过线性DNA连接作用将Seq8基因与HEV p166,p216和p222编码序列连接,然后PCR扩增重组基因,将扩增产物纯化后插入大肠杆菌表达载体pET28a(+),通过序列分析验证并确保所有的基因正确插入,并将包含目的基因的载体转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中。待克隆长出,每个蛋白挑选出几个克隆并在LB中进行培养,使用IPTG诱导剂诱导蛋白表达,运用SDS-PAGE检测大肠菌细胞裂解上清和沉淀来验证表达蛋白的可溶性。运用镍柱亲和层析法在天然条件下纯化目标蛋白。收集纯化蛋白并将其分别储存在不同的温度条件下:37℃,4℃,-20℃和-80℃。而后,使用聚丙烯胺凝胶电泳检测在不同时间点、不同蛋白的降解率,以确定重组蛋白的稳定性。最后,运用电子显微镜观察重组蛋白能否形成病毒样颗粒。结果和讨论:所有扩增的编码目的蛋白的DNA片段(单独及联合)都正确地插入到pET28a(+)载体中,重组子被成功转化至大肠杆菌感受态细胞BL21。所有目的蛋白都能够在大肠杆菌中高效表达,聚丙烯胺凝胶电泳显示:所有蛋白分子量大小都与预期一致,Seq8,Seq8-P166,Seq8-P216和Seq8-P222的分子量分别为:9.5,27.5,33.4和34 kDa。在所有蛋白中,Seq8-P222的表达量最高,其次是Seq8和Seq8-P216,表达量最低的是Seq8-P166,所有的重组蛋白均为可溶性表达,故均可使用镍柱亲和层析法在天然条件下进行纯化。在低温条件下(-20和-80℃),所有蛋白都十分稳定;在4℃和37℃条件下,Seq8-P222的稳定性高于Seq8-P216,Seq8和Seq8-P166则在两周内被完全降解。电镜下可见Seq8-P216和Seq8-P222都能够形成不同大小的病毒样颗粒(直径达到近40nm),Seq8则形成直径小于10nm的多聚体。结论:我们成功运用大肠杆菌表达系统表达了两种HEV-FMDV嵌合蛋白,命名为:Seq8-P216和Seq8-P222。这两种蛋白的表达量和溶解度都非常高,因此纯化率也高。这两种蛋白在低温环境下(-20 and-80℃)都十分稳定,并且Seq8-P222在37℃环境下仍能够保持较高的稳定性。最有意义的是,这两种蛋白均能够形成病毒样颗粒。因此,Seq8-P216和Seq8-P222被认为是十分有潜力的HEV-FMDV疫苗候选蛋白。HEV-FMDV嵌合蛋白的抗原性和免疫原性评估方法:运用间接ELISA法检测Seq8,Seq8-P216和Seq8-P222的抗原性:以目的蛋白作为包被抗原,检测受到FMDV O型血清型不同毒株感染的猪血清中的抗体;运用同样的方法检测目的蛋白与HEV中和性单克隆抗体4C5的反应;而后进一步用Western blot实验进一步检测并确认目的蛋白的抗原性。在免疫原性方面,BALB/c小鼠被分为6组,每组6只,其中Seq8,Seq8-P216和Seq8-P222组分别免疫50μg/只,P222组免疫10μg/只,商品化FMDV灭活疫苗组100μl/只,双蒸水组100μl/只。小鼠在初次免疫之后的两周接受第二次免疫,于初次免疫后的1,2,4,8和12周采集血液样本。运用间接ELISA法检测血清中HEV-和FMDV特异性抗体。结果和讨论:Western blot结果显示联合蛋白(Seq8-P216 and Seq8-P222)能够与HEV中和性单克隆抗体4C5、抗-FMDV多克隆抗体反应,而Seq8只能和抗-FMDV多克隆抗体反应。间接ELISA实验进一步证实了这些结果:Seq8和两种联合蛋白能够与不同FMDV病毒株(Mya98,Cathy,JSM and AsiaI株)诱导出的抗体反应。其中与感染Mya98 and Cathy株的猪血清反应最为重要,因为Seq8中的两个G-H环是根据这两种病毒株的序列设计的。此外,联合蛋白还与感染JSM和AsiaI株的猪血清存在交叉反应;相对于Seq8而言,Seq8-P222与猪血清的反应能力更强,这与生物信息学分析结果一致。以上结果表明:HEV和FMDV的抗原表位在重组蛋白中保存完好,在初次免疫一周之后,所有免疫的小鼠均产生了可检测到的HEV-和FMDV-特异性IgG抗体。Seq8-P216和Seq8-P222抗体产生动力学曲线相似,且在实验结束之前抗体滴度均保持不变;在1,2,4周,不同组之间小鼠血清的抗FMDV抗体水平相似,其中最高值是Seq8-P222组;Seq8和Seq8-P216组产生的FMDV特异性IgG抗体在8周之后出现显著下降且在12周时继续下降,但Seq8-P222组产生的抗体仍保持在较高水平。结论:HEV-FMDV嵌合蛋白展现了最优的抗原性和免疫原性。他们能够同时与HEV-和FMDV-特异性抗体反应并能够诱导小鼠产生同种抗体。Seq8-P222的免疫原性优于Seq8-P216,因此Seq8-P222是最优的疫苗候选。