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目的构建针对肿瘤相关基因AKT1、COX-2和PI3Kp85基因的shRNA重组腺病毒质粒表达载体,检测其在胃腺癌细胞株SGC-7901中对AKT1、COX-2和PI3Kp85基因表达的抑制作用,以及敲低靶基因的表达后,观察MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的表达变化。在体外实验中检测肿瘤细胞侵袭和迁移活性的变化,并进一步探讨COX-2和PI3K/AKT信号通路在胃腺癌侵袭迁移过程中的作用机制。方法本课题分两部分进行：第一部分设计可形成小干扰RNA的AKT1、COX-2和PI3Kp85 shRNA对应模板DNA序列,克隆至线性化质粒PEGFP6-1、PGENESIL-2、PEGFP6-4上,构建一个编码AKT1、COX-2和PI3Kp85三条shRNA的质粒表达载体。将此质粒亚克隆至腺病毒表达载体上,经酶切、测序鉴定正确后包装扩增并鉴定其病毒滴度,然后转染至SGC7901细胞中检测其转染率。第二部分在体外应用RNA干涉技术,以构建的重组腺病毒介导靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的shRNA转染人胃腺癌细胞系SGC-7901后,应用Realtime PCR和Western blot法检测目的基因的敲低情况,并用Western blot法检测RNAi敲低靶基因的表达后,COX-2及EGFR通路下游侵袭相关因子MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF的蛋白表达变化。应用ELISA检测转染前后分泌到细胞外的MM9-2和MMP-9的浓度变化。应用划痕实验、Transwell实验、2-D和3-D的Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后侵袭迁移能力的变化。结果1.通过应用定向克隆、同源重组等技术,获得一种同时包含靶向COX-2、PI3Kp85和AKT1三条RNA干扰序列的真核表达质粒,经酶切分析,测序鉴定表明构建成功后,扩增并亚克隆至重组腺病毒载体上,获得重组腺病毒质粒表达载体rAd5-C-A-P。由于重组腺病毒质粒表达载体上带有荧光蛋白表达框,所以通过转染SGC-7901后观察荧光蛋白表达情况,计算转染率>90%。2. Realtime PCR和Western blot结果提示,转染AKT1、COX-2和PI3Kp85 shRNA后可明显敲低靶基因mRNA和蛋白的表达。在靶基因被下调后通过Western blot检测发现COX-2及PI3K/AKT信号通路下游侵袭相关因子MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平均明显降低,而TIMP-2表达上调。应用ELASA检测发现rAd5-C-A-P转染组细胞培养液中MMP-2和MMP-9明显减低,划痕实验显示与对照组和无义序列组相比,rAd5-C-A-P转染组细胞迁移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示对照组和无义序列组穿过细胞数分别为(105±4)、(102.5±6.4),而rAd5-C-A-P转染组(26.4±4.6) (p<0.001).2-D的Matrigel基质生长实验显示对照组和无义序列组细胞呈正常形态贴壁生长并融合成片,而rAd5-C-A-P转染组细胞贴壁能力与迁移能力均明显减低,3-D的Matrigel基质生长实验显示与对照组和无义序列组比较,rAd5-C-A-P转染组细胞形成的细胞团块较小(p<0.001)。结论1.成功构建靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的重组腺病毒质粒表达载体,其能在体外高效转染肿瘤细胞。2.靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的RNA干扰技术可以序列特异性地抑制SGC7901细胞的AKT1、COX-2和：PI3Kp85表达,在体外实验中对胃腺癌的侵袭迁移起到了明显的抑制作用。因此靶向AKT1、COX-2和PI3Kp85的联合基因治疗有望成为胃癌基因治疗的新措施。