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我课题组合成的新化合物碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）具有拮抗心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）和心肌细胞/微血管内皮细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的作用，其主要机制包括阻断细胞膜钙通道及抑制早期生长反应基因-1（early growth response gene-1，Egr-1）过表达。进一步研究发现，F2在抑制Egr-1表达的同时还可以提高心肌组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、降低丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，间接表明F2对ROS起着负性调节作用，而给予Egr-1反义寡核苷酸也有相同作用，表明在H/R时Egr-1表达与ROS之间存在一定的关系。据文献报道，I/R或H/R时，ROS可以激活丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）。本课题组的前期研究表明体外心肌细胞H/R时，存在ROS/JNK/Egr-1信号通路，F2可通过调节此信号通路拮抗H/R损伤。本研究以MAPK三条通路为切入点，借助于大鼠心脏另一主要组成成分-微血管内皮细胞H/R模型，探讨H/R时，微血管内皮细胞内是否存在ROS/MAPK/Egr-1信号通路以及F2是否可以通过调节此通路起到拮抗H/R损伤的作用，这将进一步补充和完善F2抗心肌I/R损伤的作用机制，提高其研发价值。 方法： 1.大鼠心脏微血管内皮细胞（以下简称微血管内皮细胞）原代培养及鉴定：倒置荧光显微镜下观察培养的微血管内皮细胞形态结构，采用免疫荧光法，对微血管内皮细胞进行鉴定。 2.将培养的微血管内皮细胞随机分为以下几组：对照（control）组、control+ROS生成剂黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤（con+XO/HX）组、control+JNK/p38激动剂茴香霉素（con+ANISO）组、control+ERK1/2激动剂表皮生长因子（con+EGF）组、缺氧复氧（H/R）组、H/R+ROS清除剂依达拉奉（H/R+EDA）组、H/R+ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸组（H/R+NAC）组、H/R+JNK抑制剂SP600125（H/R+SP600125）组、H/R+p38抑制剂SB203580（H/R+SB203580）组、H/R+ERK1/2抑制剂U0126（H/R+U0126）组、H/R+F2组、H/R+F2+XO/HX（H/R+F2+XO/HX）组、H/R+F2+ANISO（H/R+F2+ANISO）组、H/R+F2+EGF（H/R+F2+EGF）组。control组于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞4 h；con+XO/HX组、con+ANISO组、con+EGF组分别于培养基中加入 XO/HX（1 mU/ml/1.2×10-4 M、3 mU/ml/3.6×10-4 M、5 mU/ml/6×10-4 M）、ANISO（40 ng/ml）、EGF（50 ng/ml）常氧培养1 h；H/R组细胞换用被高纯氮气饱和30 min的缺氧液，置缺氧盒中37℃密闭培养3 h，然后换用正常培养基于常规条件下培养细胞1 h，建立H/R损伤模型；H/R+EDA组、H/R+NAC组于缺氧前30 min、缺氧液及复氧培养基中分别给予EDA（5×10-5 M、1×10-4 M、2×10-4 M)、NAC（2×10-5 M、1×10-4 M、5×10-4 M）；H/R+F2组于缺氧前30 min和缺氧阶段给予F2（10-7 M、10-6 M、10-5 M），复氧阶段不再给药；H/R+SP600125组、H/R+SB203580组、H/R+U0126组分别于缺氧前45 min给予SP600125（1×10-5 M）、SB203580（2×10-5 M）、U0126（1×10-5 M）；H/R+F2+XO/HX组、H/R+F2+ANISO组和H/R+F2+EGF组于缺氧前孵育F2（10-6 M）30 min，缺氧阶段共同孵育F2+XO（1 mU/ml）/HX（1.2×10-4 M）、F2+ANISO（40 ng/ml）、F2+EGF（50 ng/ml）3 h，复氧阶段不再给药。 3.流式细胞仪法检测微血管内皮细胞内ROS水平：明确H/R时，细胞内ROS的生成情况，以及F2对其调节作用。 4. Western-blot方法检测微血管内皮细胞内Egr-1、磷酸化JNK（p-JNK）、JNK、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2、磷酸化p38（p-p38）和p38蛋白的表达的变化：分别借助ROS、JNK、p38和ERK1/2的激动剂和抑制剂，明确ROS/MAPK/Egr-1信号通路是否参与微血管内皮细胞H/R损伤及F2于其中的作用。 5. Real-Time PCR方法检测微血管内皮细胞内Egr-1 mRNA水平，与蛋白水平上Egr-1变化相互辅证。 6.免疫荧光法检测H/R时，Egr-1蛋白的核转位情况以及F2、ROS清除剂、MAPK抑制剂对H/R时Egr-1蛋白核转位的影响。明确在相应刺激下Egr-1作为转录因子的核转位情况。 7.凝胶迁移实验检测H/R时，Egr-1转录因子活性变化以及F2对其调节作用。 8.硫代巴比妥酸法和发光法检测H/R时微血管内皮细胞内MDA含量和GSH/GSSG比例变化以及ROS清除剂NAC、MAPK抑制剂U0126、SP600125、SB203580和F2对其的影响；MTT法检测H/R时微血管内皮细胞存活率以及MAPK抑制剂U0126、SP600125、SB203580和F2对其的调节作用。通过氧化应激损伤指标以及细胞生存率探讨ROS/MAPK/Egr-1通路于H/R中的作用。 结果： 1. H/R促使微血管内皮细胞内ROS生成增多，ERK1/2、JNK、p38激活，Egr-1 mRNA和蛋白高表达，Egr-1核转位和DNA结合活性增加；F2能使H/R所致的ROS含量降低，下调H/R所致p-JNK、p-p38、p-ERK1/2、Egr-1 mRNA及蛋白的高表达，且呈一定的剂量依赖性，并可使Egr-1核转位和DAN结合活性降低。 2. ROS清除剂可降低微血管内皮细胞H/R时ROS含量，下调H/R所致JNK、p38、ERK1/2活化，同时降低Egr-1 mRNA和蛋白的高表达，NAC可减少H/R时Egr-1的核转位；ROS生成剂XO/HX可使得微血管内皮细胞内ROS、p-JNK、p-p38、p-ERK1/2、Egr-1 mRNA以及蛋白表达升高，并可拮抗F2对H/R时ROS含量、MAPK激活以及Egr-1蛋白表达的抑制作用。 3. JNK、p38、ERK1/2抑制剂SP600125、SB203580、U0126均可抑制H/R时Egr-1蛋白的高表达，并减少H/R时Egr-1蛋白的核转位；JNK与p38共同激动剂ANISO、ERK1/2激动剂EGF可刺激微血管内皮细胞内Egr-1高表达，并可拮抗F2对H/R时MAPK激活和Egr-1蛋白表达的抑制作用。 4. ROS清除剂、MAPK抑制剂、F2可降低H/R引起的MDA高水平，升高GSH/GSSG比例，MAPK抑制剂、F2可提高细胞生存率。 结论： 1. H/R可导致心脏微血管内皮细胞ROS/Egr-1信号通路激活，JNK、p38及ERK1/2的活化于此通路中起了重要的介导作用。 2. F2对H/R所致的ROS/MAPK/Egr-1信号通路活化具有调节作用，这可能是其拮抗心肌I/R损伤的一个重要机制。