目的探索过氧化物酶增殖体活化受体γ（peroxidase activated receptor gamma,PPARγ）-沉默信息调节因子相关酶1（silent information regulation factor related enzyme 1,SIRT1）反馈环路在激素耐药NZB/WF1狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞内脂代谢紊乱中的作用机理,阐明激素耐药与脂代谢紊乱之间的内在关联;证实三七皂苷（panax notoginseng saponins,PNS）通过调控PPARγ-SIRT1反馈环路起到既逆转激素耐药又能改善细胞内脂代谢紊乱的双重效应,探究活血化瘀中药在激素耐药狼疮肾炎中的作用及其机制,为中医药提高难治性狼疮肾炎的临床疗效提供新的有益思路和科学依据。方法1.采用密度梯度法分离NZB/WF1狼疮小鼠脾淋巴细胞,用小剂量甲基强的松龙（终浓度2μg/m L,培养72h）诱导构建激素耐药细胞模型,通过流式细胞术和自动生化分析仪测定分离细胞成分;台盼蓝染色测定分离细胞活力;流式细胞术检测P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）及其转运底物罗丹明-123的表达。2.将NZB/WF1狼疮小鼠激素耐药淋巴细胞分为模型组、PPARγ质粒转染组、PPARγsi RNA组、SIRT1si RNA组、SIRT1质粒转染组,并设正常小鼠组和NZB/WF1狼疮小鼠组,各组分别干预72h。采用荧光显微镜及流式细胞术检测si RNA及慢病毒质粒的转染效率。通过免疫共沉淀（CO-IP）法和超迁移EMSA（Super-shift-EMSA）法检测PPARγ与SIRT之间的相互作用;荧光定量Real-Time PCR法检测PPARγ和SIRT1m RNA表达;Western blotting法检测PPARγ和SIRT1蛋白表达,以此探索PPARγ和SIRT1在NZB/WF1狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞激素耐药与脂代谢紊乱之间的内在关联和作用机制。3.将激素耐药的NZB/WF1狼疮小鼠淋巴细胞分为模型组、PPARγsi RNA+三七皂苷组、PPARγ质粒转染组、三七皂苷组,并将NZB/WF1狼疮小鼠作为对照组,各组分别干预72h。通过荧光定量Real-Time PCR法检测PPARγ和SIRT1m RNA表达;Western blotting法检测PPARγ和SIRT1蛋白表达;荧光分光光度计测定脾淋巴细胞内胆固醇酯含量;荧光酶标法检测脾淋巴细胞内胆固醇流出率;流式细胞术检测淋巴细胞内三磷酸腺苷结合盒转运体A1（adenosine triphosphate binding cassette transporter A1,ABCA1）蛋白表达,以此观察三七皂苷干预对激素耐药和细胞内脂代谢紊乱的影响效应。结果1.分离细胞样本经自动生化分析仪检测淋巴细胞比率为97.2%（7.4×109/L）,流式细胞仪检测淋巴细胞比率为94.5%。台盼蓝染色测定活细胞数大于97%。NZB/WF1狼疮小鼠脾淋巴细胞经小剂量甲基强的松龙诱导后P-gp表达显著上调（38.6±2.2%vs NZB/WF1狼疮小鼠组7.8±1.4%）、细胞内罗丹明-123积累明显下降（33.20±1.7%vs NZB/WF1狼疮小鼠组44.90±1.8%）,差异具有统计学意义（p<0.05）。2.流式细胞仪检测SIRT1si RNA转染率92±2.2%,PPARγsi RNA转染率90±1.8%（p<0.05）;SIRT1慢病毒质粒转染率66±3.1%,PPARγ慢病毒质粒转染率70±2.5%（p<0.05）,均达到良好的转染效果。CO-IP和Super-shift-EMSA检测NZB/WF1狼疮小鼠激素耐药和NZB/WF1狼疮小鼠中均存在PPARγ和SIRT1之间的相互作用（p<0.05）。与正常小鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA组、SIRT1si RNA组、SIRT1质粒转染组、LN鼠组中PPARγm RNA均显著降低（1±0.0028vs0.0284±0.0032、0.0084±0.0044、0.3231±0.0037、0.0148±0.0023、0.1386±0.0018,p<0.01）,PPARγ质粒转染组显著上调（1±0.0028vs7.674±0.0047,p<0.01）;与模型组比较,PPARγ质粒转染组、LN鼠组、SIRT1si RNA组PPARγm RNA均增高（0.0284±0.0032 vs 7.674±0.0047、0.1386±0.0018、0.3231±0.0037,p<0.05）,PPARγsi RNA组、SIRT1质粒转染组PPARγm RNA均降低（0.0284±0.0032vs 0.0084±0.0044、0.0148±0.0023,p<0.05）。与正常组比较,模型组、PPARγ质粒转染组、PPARγsi RNA组、SIRT1质粒转染组、LN鼠组SIRT1m RNA均增高（1±0.0030vs3.2490±0.0028、1.5052±0.0036、4.2871±0.0021、5.5790±0.0042、2.0280±0.0024,P<0.05）,SIRT1si RNA组下调（1±0.0030vs 0.0458±0.0033,p<0.01）;与模型组比较,SIRT1质粒转染组、PPARγsi RNA组SIRT1m RNA增高（3.2490±0.0028vs5.5790±0.0042、4.2871±0.0021,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、SIRT1si RNA组、LN鼠组SIRT1m RNA降低（3.2490±0.0028vs1.5052±0.0036、0.0458±0.0033、2.028±0.0024,P<0.05）。与正常小鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA组、SIRT1si RNA组、SIRT1质粒转染组、LN鼠组中PPARγ蛋白表达均降低（0.89±0.05vs0.55±0.08、0.18±0.09、0.72±0.05、0.32±0.04、0.62±0.02,p<0.05）,PPARγ质粒转染组增高（0.89±0.05vs0.99±0.17,p<0.05）;与模型组比较,PPARγ质粒转染组、LN鼠组、SIRT1si RNA组PPARγ蛋白均增高（0.55±0.08vs0.99±0.17、0.62±0.02、0.72±0.05,p<0.05）,PPARγsi RNA组、SIRT1质粒转染组PPARγ蛋白均降低（0.55±0.08vs0.18±0.09、0.32±0.04,p<0.05）。与正常小鼠组比较,模型组、PPARγ质粒转染组、PPARγsi RNA组、SIRT1质粒转染组、LN鼠组SIRT1蛋白均增高（0.41±0.03vs 0.78±0.02、0.52±0.04、0.80±0.05、0.88±0.13、0.71±0.06,P<0.05）,SIRT1si RNA组下降（0.41±0.03vs0.20±0.08,p<0.01）;与模型组比较,SIRT1质粒转染组、PPARγsi RNA组SIRT1蛋白表达增高（0.78±0.02vs0.88±0.13、0.80±0.05,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、SIRT1si RNA组、LN鼠组SIRT1蛋白降低（0.78±0.02vs0.52±0.04、0.20±0.08、0.69±0.06,P<0.05）。与LN鼠组比较,模型组中PPARγm RNA和蛋白表达均降低（0.1386±0.0018vs0.0284±0.0032、0.62±0.02vs0.55±0.08,p<0.05）,SIRT1m RNA和蛋白表达表达上升（2.028±0.0024vs3.2490±0.0028、0.69±0.06vs0.78±0.02,P<0.05）。人为上调PPARγm RNA后,SIRT1m RNA和蛋白表达均降低（P<0.05）;沉默SIRT1m RNA后,PPARγm RNA和蛋白表达均增高（P<0.05）。人为上调SIRT1m RNA后,PPARγm RNA和蛋白表达均降低（P<0.05）;沉默PPARγm RNA后,SIRT1m RNA和蛋白表达均增高（P<0.05）。3.与LN鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA+三七皂苷组中PPARγm RNA表达下降（1±0.0053 vs0.0083±0.0042、0.0197±0.0085,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、三七皂苷组PPARγm RNA增高（1±0.0053vs2.9281±0.0035、1.7654±0.0071,P<0.05）。与模型组比较,PPARγsi RNA+三七皂苷组PPARγm RNA下降（0.0083±0.0042vs0.0197±0.0085,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、三七皂苷组PPARγm RNA增高（0.0083±0.0042vs2.9281±0.0035、1.7654±0.0071,P<0.05）。与LN鼠组比较,模型组SIRT1m RNA增高（1±0.0064vs2.1584±0.0024,P<0.05）,PPARγsi RNA+三七皂苷组、PPARγ质粒转染组、三七皂苷组SIRT1m RNA降低（1±0.0064vs0.1037±0.0061、0.0097±0.0033、0.0074±0.0092,P<0.05）。与模型组比较,PPARγsi RNA+三七皂苷组、PPARγ质粒转染组、三七皂苷组SIRT1m RNA降低（2.1584±0.0024vs0.1037±0.0061、0.0097±0.0033、0.0074±0.0092,P<0.05）。与LN鼠比较,模型组、PPARγsi RNA+三七皂苷组PPARγ蛋白降低（0.32±0.06vs0.24±0.07、0.22±0.08,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、三七皂苷组PPARγ蛋白升高（0.32±0.06vs0.76±0.06、0.75±0.04,P<0.05）。与模型组比较,PPARγ质粒转染组、三七皂苷组PPARγ蛋白升高（0.24±0.07vs0.76±0.06、0.75±0.04,P<0.05）,而PPARγsi RNA+三七皂苷组PPARγ蛋白无统计学意义（0.24±0.07vs0.22±0.08,P>0.05）。与LN鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA+三七皂苷组SIRT1蛋白增高（0.52±0.05vs 0.99±0.03、0.87±0.02,P<0.05）,PPARγ质粒转染组、三七皂苷组SIRT1蛋白降低（0.52±0.05vs0.42±0.09、0.33±0.06,P<0.05）。与模型组比较,PPARγsi RNA+三七皂苷组、PPARγ质粒转染组、三七皂苷组SIRT1蛋白均降低（0.99±0.03vs0.87±0.02、0.42±0.09、0.33±0.06,P<0.05）。与LN鼠比较,模型组、PPARγsi RNA+PNS细胞内胆固醇酯含量降低（1.413±0.035vs0.762±0.071、0.824±0.045,P<0.05）;PPARγ质粒转染组、PNS组中胆固醇酯含量升高（1.413±0.035vs2.347±0.032、2.036±0.087,P<0.05）。与模型组比较,PPARγ质粒转染组、PNS组中胆固醇酯的含量上升（0.762±0.071vs2.347±0.032、2.036±0.087,P<0.05）,PPARγsi RNA+PNS组无显著差异（0.762±0.071vs0.824±0.045,P>0.05）。与LN鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA+PNS组、PPARγ质粒转染组、PNS组淋巴细胞内胆固醇流出率均升高（10.4±2.5vs34.7±3.4、26.2±2.3、20.3±3.2、15.8±2.2,P<0.05）。与模型组比较,PPARγsi RNA+PNS组、PPARγ质粒转染组、PNS组淋巴细胞内胆固醇流出率均降低,其中三七皂苷组最低（34.7±3.4vs26.2±2.3、20.3±3.2、15.8±2.2,P<0.05）。与LN鼠组比较,模型组、PPARγsi RNA+PNS组ABCA1蛋白表达增高（21.8±2.6%vs45.2±3.2%、34.7±2.5%,P<0.05）,PPARγ质粒转染组和PNS组ABCA1蛋白表达降低（21.8±2.2%vs17.5±2.4%、13.6±3.0%,P<0.05）;与模型组比较,PPARγsi RNA+PNS组、PPARγ质粒转染组、PNS组中ABCA1蛋白表达均下调,其中PNS组ABCA1蛋白下降程度最高（45.2±3.2%vs34.7±2.5%、17.5±2.4%、13.6±3.0%,P<0.05）。结论1.小剂量甲基强的松龙可诱导NZB/WF1狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞产生激素耐药。2.发现并证实激素耐药的NZB/WF1狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞中PPARγ和SIRT1之间存在一个相互抑制的负反馈环路。该反馈环路的异常激活是导致SIRT1介导（前期研究已证实的SIRT1/Fox O1/MDR1/P-gp信号通路）的狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞激素耐药的重要机制之一;同时,由于该作用环路的存在,一定程度上导致激素耐药的加剧。并且在PPARγ介导的细胞内脂代谢调控中具有重要作用。3.激素耐药的NZB/WF1狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞内PPARγ处于低水平状态存在脂代谢紊乱;激素耐药细胞存在细胞内胆固醇外流异常状态。4.在体外细胞层面证实三七皂苷能通过PPARγ-SIRT1负反馈环路,既逆转激素耐药又改善脂质代谢紊乱的双重效应,表明以三七为代表的活血化瘀类中药的多层次调控效应,对防治动脉粥样硬化,改善患者远期预后具有重要临床意义,并为提高难治性LN临床疗效探寻可能的新干预靶点提供了科学依据。