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1.捻转血矛线虫精氨酸激酶体外抑制山羊外周血单核细胞(PBMC)增殖并促进其凋亡精氨酸激酶(AK)是磷酸原激酶家族的重要成员,在脊椎动物和无脊椎动物中得到广泛研究。AKs是身体的重要组成部分,参与各项细胞生物学过程,并被认为是有效的免疫调节剂和促炎性细胞因子。然而,捻转血矛线虫(HHaemonchus contortus,Hc)的AK触发的宿主细胞免疫调节反应仍是未知的。本研究对Hc-AK进行克隆、表达,并评价其在体外条件下对山羊外周血单个核细胞(PBMCs)的细胞因子产生、细胞增殖、细胞迁移、NO产生和细胞凋亡等的调节作用。本章应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了 Hc-AK基因全长,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a。通过亲和层析纯化重组Hc-AK蛋白,并对其进行酶学测定。通过免疫荧光试验(IFA)验证体外rHc-AK与PBMC的结合。通过免疫组化检测Hc-AK在成虫中的定位。通过rHc-AK与山羊PBMC共孵育研究rHc-AK对细胞因子分泌,细胞增殖,细胞迁移,一氧化氮产生和凋亡的免疫调节作用。本章成功克隆了完整的Hc-AK基因(1,080bp),并且重组蛋白以His标签融合蛋白的可溶形式在大肠杆菌BL21中成功表达。Hc-AK(rHc-AK)的重组蛋白大小约为58.5kDa,其中包含约18kDa的载体蛋白。生化检测显示Hc-ak编码的蛋白具有酶活性。Western结果证实,rHc-AK可以被大鼠抗-Hc-AK血清所识别。IFA结果显示rHc-AK结合在山羊PBMC表面。免疫组化分析显示,Hc-AK定位于成虫的内膜和外膜以及肠道。rHc-AK与宿主细胞的结合能够增加IL-4,IL-10,IL-17,IFN-y水平,促进一氧化氮(NO)的产生和PBMCs的凋亡,而抑制TGF-β水平、PBMCs的增殖和迁移,且均呈剂量依赖性。我们的研究结果表明,rHc-AK是一种重要的排泄分泌(ES)蛋白,与宿主免疫反应有关,在与山羊PBMCs相互作用过程中发挥免疫调节作用。2.捻转血矛线虫排泄分泌抗原rHcES-15的表达及其对山羊PBMC功能的影响捻转血矛线虫排泄分泌抗原的研究,是了解蠕虫免疫调节分子基础,科学家们比较感兴趣。在此研究中,捻转血矛线虫15kDa排泄分泌抗原(HcES-15)被成功克隆到表达载体系统中,并且评价了其对宿主PBMC功能的影响。以捻转血矛线虫cDNA为模板,通过PT-PCR技术扩增了 HcES-15基因并将其亚克隆到pET32a中,IPTG诱导表达得到重组蛋白rHcES-15。通过IFA证实rHcES-15与山羊外周血单核细胞(PBMC)的结合活性,免疫组化分析显示HcES-15定位于成虫的外部和内部结构,证明该蛋白为寄生虫的ES抗原。通过rHcES-15与山羊PBMCs共孵育研究了 rHcES-15对细胞因子分泌,细胞增殖,细胞迁移,一氧化氮产生和凋亡的影响。结果显示,PBMC细胞与不同浓度的rHcES-15蛋白共培养后,IL-4,IL-10,IL-17,一氧化氮(NO)生成,PBMC凋亡和单核细胞吞噬功能均有所升高。我们还发现IFN-y,TGF-β1,细胞增殖和迁移被rHcES-15蛋白显著抑制。试验结果表明,捻转血矛线虫的低分子量ES抗原具有不同的免疫调节作用,这将有助于了解寄生虫在与宿主相互作用过程中免疫逃避的机制。3.捻转血矛线虫原肌球蛋白体外对山羊PBMC功能的抑制在宿主-寄生虫相互作用过程中,排泄分泌蛋白(ESP)的功能性免疫调节基于与宿主免疫细胞的结合。本章成功克隆并表达了捻转血矛线虫原肌球蛋白(Hc-TpMy),可被抗rHc-TpMy大鼠血清识别。免疫荧光结果显示rHc-TpMy可结合于PBMC表面。免疫组化结果显示Hc-TpMy蛋白定位于成虫的肌肉组织中。此外,观察到rHc-TpMy对细胞因子表达,PBMC增殖和迁移,一氧化氮(NO)产生,凋亡和单核细胞吞噬作用具有调节作用。结果显示,rHc-TpMy与山羊PBMCs共孵育可显著降低IL-4和IFN-γ水平,抑制PBMC增殖和迁移,抑制一氧化氮(NO)产生。然而,可提高IL-10,IL-17和TGF-β1水平,促进PBMC的凋亡和吞噬功能,均呈剂量依赖性升高。我们的研究结果表明rHc-TpMy作为一种重要的排泄分泌蛋白,对山羊PBMCs表现出明显的抑制作用,为研究血吸虫病的免疫逃避机制的提供参考。4.捻转血矛线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1对山羊PBMC的功能的影响丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶作为寄生性排泄分泌抗原的组成部分,参与调节宿主免疫细胞的各种免疫生物学功能。然而,关于这些磷酸酶的免疫调节和免疫保护作用的尚未研究。本章通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增捻转血矛线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的开放阅读框(ORF),将其命名为HcSTP-1。951bp个核苷酸编码316个氨基酸,保守区有GDXHG,GDYVDRG,GNHE,HGG,RG和H。包含18kDa载体蛋白在内的重组蛋白分子量约为35kDa。免疫组化结果显示,HcSTP-1定位在雄性和雌性成虫虫体部分。免疫荧光法(IFA)试验发现,rHcSTP-1可与山羊外周血单个核细胞(PBMCs)表面结合。实时荧光定量PCR结果显示,rHcSTP-1与PBMC共同孵育后,可上调IL-2,TGF-β1,IFN-y和IL-17(10μg/ml)水平,IL-10水平下降,IL-6没有变化。进一步的试验显示HcSTP-1可诱导PBMCs迁移和凋亡,促进一氧化氮(NO)产生,而抑制PBMCs增殖并呈现浓度依赖性。研究结果表明,HcSTP-1蛋白在山羊PBMCs中起着重要的调控作用,今后可能成为控制捻转血矛线虫感染的潜在分子靶点。5.捻转血矛线虫延伸因子1α对山羊PBMC功能的影响捻转血矛线虫排泄分泌蛋白(HcESPs)广泛参与宿主细胞互作,调节宿主免疫系统。延伸因子1α(HcEF-1α)是一种重要的捻转血矛线虫ES蛋白,本章研究中我们克隆了该基因并且评价了其对山羊外周血单核细胞(PBMC)功能的影响。将纯化后的重组HcEF-1α与山羊PBMC共同孵育,观察其对细胞因子分泌,细胞增殖,细胞迁移,一氧化氮合成和凋亡的影响。Western blot结果显示,重组EF-1α可被自然感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别。免疫荧光试验发现rHcEF-1α可与PBMC表面结合。此外,EF-1α定位于成虫捻转血矛线虫的内外膜结构以及肠道上皮细胞,证明该蛋白为四期成虫阶段的ES蛋白。我们的研究表明rHcEF-1α可以促进IL-4,IL-17,IFN-y和TGF-β31的产生,促进PBMCs迁移和增殖,诱导PBMCs凋亡。此外,rHcEF-1α与山羊PBMC孵育,抑制IL-10和一氧化氮的产生(NO)。表明该蛋白有可能介导宿主寄生虫相互作用过程中的Th1免疫反应。6.捻转血矛线虫甲基转移酶-12的鉴定及其对山羊PBMC功能的影响捻转血矛线虫发育阶段中L4+L5期的排泄和分泌蛋白广泛涉及对宿主PBMC的调节作用。本研究中,我们通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了捻转血矛线虫的一个新基因(764个碱基对),命名为HcMTF-12,并且在大肠杆菌BL21(DE3菌株)中进行了表达。通过12%丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析该重组蛋白含有254个氨基酸。通过免疫组织化学分析该蛋白定位于成虫,表明该蛋白为ES蛋白。使用大鼠和山羊抗血清通过Western-blot分别对天然(MTF-12)和rHcMT-12蛋白进行识别。通过免疫荧光测定进一步验证证实rHcMTF-12可与山羊PBMC结合。rHcMTF-12对细胞因子转录的免疫调节分析显示可以增加IL-2,IL-4,IL-17和IFN-y转录并呈剂量依赖性(p<0.001)。rHcMTF-12与PBMC共孵育后,分泌物中IL-10和TGF-β1的含量显着降低(p<0.001),然而与对照组相比,IL-6的差异不显著(p<0.662)。此外,PBMC与rHcMTF-12共孵育后,可诱导细胞聚集和产生一氧化氮,但是,其细胞增殖受到影响。研究结果表明,捻转血矛线虫MTF-12能显着调节PBMC的功能,可以作为抗捻转血矛线虫感染的候选抗原。