先天免疫作为机体抵抗感染最重要的第一步,能有效锁定微生物,控制并进而清除感染。免疫系统中的非特异性免疫细胞(如树突状细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞等),还有一些非细胞成分(如补体和抗菌肽等),以及机体与外界间的生理屏障共同构成了机体的先天免疫系统。先天免疫失调或缺陷会增加宿主对细菌、病毒及真菌等的易感性。实践及临床研究证明中药具有良好的免疫调节功能。而树突状细胞是连接机体先天免疫与后天免疫之间的桥梁,故可能成为研究中药免疫调节作用的关键。蟾酥作为我国传统中药,具有开窍止痛、解毒消肿之功效,目前已广泛用于治疗多种顽固性疾病,如呼吸道感染、慢性阻塞性肺病、乙型肝炎及流行性腮腺炎等。华蟾毒精(CBG)作为蟾酥主要有效成分之一,具有强心、止痛、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性。然而,有关华蟾毒精对先天免疫细胞尤其是对树突状细胞作用的报道却非常有限。本文主要探讨了华蟾毒精对先天免疫相关细胞尤其是树突状细胞免疫功能的影响,为该药物及蟾酥的临床应用提供理论基础和实验依据。首先,通过质谱和内毒素含量检测方法对所用CBG质量进行了评价,发现本课题中所用CBG质量可靠且无内毒素污染,为后续实验奠定基础。其次,通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)对外周血中提取到的单核细胞进行诱导分化的方法得到原代树突状细胞。采用流式细胞术、免疫荧光染色、实时变形流式、ELISA、Western Blot、实时荧光定量PCR等方法分别检测了华蟾毒精对树突状细胞活性、机械表型、caspase酶活性、抗原摄取、抗原递呈、细胞因子分泌、抗菌肽表达、杀菌作用等多方面的影响。结果发现,CBG并不能引起细胞坏死,但是高剂量CBG(1?g/ml)可诱导部分细胞凋亡,而这种凋亡与多种Caspase酶活化有关。纯化的树突状细胞通过实时变形流式得到的两个种群对CBG的敏感性不同,而且反应方向也不同。同时发现CBG抑制了树突状细胞对肺炎链球菌的吞噬能力,抑制了LPS诱导的树突状细胞成熟,包括下调MHC II类分子、CD80及CD86表面蛋白的表达及抑制细胞因子IL-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α等的分泌。然而,CBG却能显著促进IL-1β的表达与分泌,且这种促分泌作用与caspase-1酶的活化有关。此外,CBG能促进树突状细胞抗菌肽β防御素-2(h BD-2)和3(h BD-3)的表达,同时改善LPS对抗菌肽分泌的抑制作用。CBG刺激后的树突状细胞上清液对肺炎链球菌具有一定抑菌作用,而CBG本身并没有直接的抑菌效果。为了进一步阐明CBG对树突状细胞功能的作用机制,我们在第二章中利用RT2 profiler PCR array技术分别检测了其对树突状细胞Toll样受体(TLRs)信号转导通路(84个相关基因)及炎性小体通路(84个相关基因)相关基因表达的影响。结果发现:华蟾毒精能明显影响树突状细胞炎症小体通路及Toll样受体信号传导通路中多种基因的表达。通过促进P2X7受体、NOD样受体NLRP1及NF-k B相关基因表达来激活炎性小体信号通路,可能是华蟾毒精造成树突状细胞caspase-1活化与IL-1β分泌而触发炎症反应的作用机制。同时,华蟾毒精也能降低TLR5、TLR2、TLR8、NLRC4及CD14等多种模式识别受体相关基因的表达,且促进NFKBIA等NF-κB抑制蛋白的相关基因表达,从而控制过度炎症反应。鉴于本实验中所用树突状细胞为外周血单核细胞来源,故第三章就CBG对原代单核细胞免疫功能的影响进行了研究,同时也评价了其对THP-1单核细胞系的作用。通过LDH检测细胞毒性,ELISA检测上清中不同细胞因子及抗菌肽分泌水平,流式细胞技术检测细胞casapase-1酶活性及实时荧光定量PCR检测相关基因表达,结果发现CBG对原代单核细胞毒性较弱,但是对癌症来源的THP-1单核细胞系毒性明显;CBG在1?g/m L浓度时能显著提高原代单核细胞分泌IL-1β,与对照组相比升高51倍;在0.1?g/m L及1?g/m L浓度时均能显著提高原代单核细胞分泌IL-8,其中0.1?g/m L浓度时IL-8分泌升高21倍;CBG单独作用不能诱导THP-1细胞分泌IL-1β,但与LPS联合作用后,IL-1β分泌量有所升高;CBG不能诱导原代单核细胞抗菌肽h BD2、h BD3及LL-37的表达,但可诱导THP-1细胞表达并分泌h BD2及h BD3。第四章就CBG对中性粒细胞免疫功能的影响进行了研究。通过LDH法检测细胞活性,ELISA检测上清中细胞因子及抗菌肽HNP1-3分泌水平,Western Blot检测上清中抗菌肽h CAP18/LL-37分泌水平,实时荧光定量PCR检测相关基因表达水平,以及菌落计数检测抑菌作用,结果发现,CBG对中性粒细胞没有毒性且对主要细胞因子生成无明显影响,能显著促进抗菌肽HNP1-3及h CAP18/LL37的分泌,且经CBG作用后的中性粒细胞对肺炎链球菌的抑菌作用明显增强。考虑到免疫系统是一个整体且免疫细胞之间存在复杂而紧密的联系,故最后以全血及外周血单个核细胞(PBMCs)为研究对象,初步探讨了华蟾毒精对血液中多种细胞的整体作用。通过LDH法检测细胞毒性,并通过ELISA法检测细胞因子分泌水平,结果发现CBG对全血及PBMCs细胞无明显毒性;CBG单独可诱导全血分泌IL-1β并可提高LPS诱导的IL-1β分泌;尽管CBG单独不能诱导PBMCs分泌IL-1β,但可提高LPS诱导的IL-1β分泌量;CBG极显著抑制LPS诱导的PBMCs分泌IL-10和IL-8;CBG在0.01?g/m L浓度时对PHA诱导的IFN-γ分泌有升高趋势,但差异不显著,而1?g/m L浓度时则显著性抑制该分泌。综上所述,华蟾毒精能针对树突状细胞、单核细胞及中性粒细胞等不同的先天免疫细胞的功能进行有效调节。