目的:宫颈癌(cervical cancer)是最常见的妇科恶性肿瘤。在全球范围内,每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家,宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤,排行首位。我国每年新发现的病例为13.15万,其死亡率排在总癌症死亡率的第一位。细胞凋亡(apoptosis)是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。由于细胞凋亡异常在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用,因此以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术己经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。熊果酸(ursolic acid,UA)属五环三萜类化合物,具有广泛的生物活性,抗肿瘤活性是其最主要的药理作用,其抗肿瘤作用是多方面的,并且资源丰富,开发应用前景广阔,作为一种抗肿瘤药物,与其它化疗药物相比,具有毒副作用低的特点,是一种有潜力的肿瘤防治药物。其抗肿瘤细胞方面的研究将是熊果酸系列抗癌药物研发的重要步骤及未来开发的一个方向和热点,熊果酸有望成为一种高效低毒的抗肿瘤新药。本实验旨在探讨熊果酸对人宫颈癌HELA细胞株的增殖抑制作用及诱导凋亡作用,为其抗宫颈癌活性奠定细胞学基础。方法:1.熊果酸实验浓度为0、20、40、80μmol/L,测定时间点分别为熊果酸作用24、48、72小时。用四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法)测定熊果酸在不同浓度下对HELA细胞的增殖抑制效应。用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用培养液将细胞配成单细胞悬液。将细胞浓度调节至1.0x105/m1,在96孔板中每孔加入细胞悬液200μl。培养细胞,直至培养板内80%的细胞呈汇合状态,将培养液吸出,加入无血清DMEM同步24小时(同步指在无血清培养的条件下,后所培养细胞趋于处在同一增殖周期)加入熊果酸使终浓度为0、20、40、80μmol/L,每组设4个复孔。将96孔板置于培养箱内分别培养24、48和72h后加入浓度为5g/L的MTT20μl,继续培养4h,轻缓吸去孔内培养上清,每孔加入DMSO 150μl,于脱色摇床上振荡10min后置于酶标仪490nm波长处测吸光度值。计算增殖抑制率(IR%)=(1-处理组吸光度值/对照组吸光度值)X100%,通过直线回归方程计算IC50。实验重复4次,取其均值。2.应用流式细胞仪分别测定在不同时间下,一定剂量的熊果酸诱导HELA细胞发生凋亡的作用。应用流式细胞术Annexin V-FITC/PI细胞凋亡染色法直接检测细胞的凋亡坏死。取处于对数生长期的HELA细胞,用0.25%胰蛋白酶短时间消化细胞,培养液重悬细胞,调整配成细胞浓度为1.0x105/m1,接种于6孔板中,加入终浓度为0、20μmol/L的熊果酸,分别作用24、48和72小时。之后按试剂盒使用说明书上的步骤进行染色,随即进行流式细胞仪检测,实验重复3次取其均值。3.应用荧光显微镜从形态学上观察熊果酸诱导细胞凋亡的情况。取处于对数生长期的HELA细胞,用0.25%胰蛋白酶短时间消化细胞,培养液重悬细胞,调整配成细胞浓度为4.0x105/m1,接种于6孔板中,加入终浓度为0、20μmol/L的熊果酸,作用48小时,应用Annexin V-FITC/PI进行染色,置于荧光显微镜下观察细胞凋亡的情况, 4.所得数据使用SPSS16.0统计软件分析。结果:1.MTT结果显示熊果酸具有抑制HELA细胞增殖的作用;给药浓度与作用时间是影响HELA细胞增殖的主要因素。。2.流式细胞仪结果显示UA可以诱导HELA细胞凋亡。20μmo/LUA作用HELA细胞24、48、72小时后凋亡率分别为(6.64±1.01)%、(13.71±1.01)%、(18.60±2.51)%(P<0.05)。3. 0μmol/L的熊果酸与20μmol/L的熊果酸分别作用HELA细胞48h后,经Annexin V-FITC/PI染色,荧光显微镜下观察未经药物处理的细胞核表面光滑,发出的荧光均匀,药物处理后细胞呈现红色荧光。结论:1.熊果酸具有抑制HELA细胞增殖的作用;随着药物浓度的增加, HELA细胞的增殖抑制率也增加,随着作用时间的延长,HELA细胞的增殖抑制率也增加。2.20μmol/L熊果酸具有诱导HELA细胞凋亡的作用;当药物浓度一定时,随着作用时间的延长,HELA细胞的凋亡率也增加。