岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferases,FucTs)可以催化反应生成一系列含岩藻糖基的寡糖及其糖缀合物,在许多复杂的生理和病理过程中发挥着不可替代的重要作用。研究表明,含岩藻糖基的异常糖链结构与肿瘤的发生和发展密切相关,不仅可以作为肿瘤诊断的关键分子标记,也被研究开发成抗肿瘤糖疫苗用于癌症免疫治疗。另有研究表明人乳中岩藻糖基化的寡糖的含量高达77%,它们作为重要的益生元,具有显著促进脑部发育、抑制病毒和病原菌的感染以及参加机体免疫应答等生理功能,广泛地应用于婴幼儿配方奶粉、保健药品、食品添加剂以及功能性饮料等领域。因此,开发FucTs的单细胞高通量筛选方法,并利用定向进化技术提升天然酶的催化活性,不仅为产业应用提供性质优良的突变酶,而且对于理解FucTs的分子构效关系也具有重要意义。为提高岩藻糖基转移酶的催化效率,并以此揭示其分子构效关系,本论文首次开发了针对幽门螺杆菌Helicobacter pylori NCTC11639α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-FucT)的荧光激活细胞分选(FACS)超高通量筛选方法,可使筛选速度达到每小时10~7以上,并通过优化菌体诱导时间、荧光扩散效率、供受体比例以及反应时间等条件,提高了筛选系统的效率;在流式细胞仪上进行模式筛选,表达了α-1,3-FucT的大肠杆菌从大量无酶活性细胞中富集的倍数高达10~4倍;我们进一步开发了Cast-PCR对高/低活性细胞定量模式筛选的方法,证明了该筛选方法对高活性的细胞富集效率达近20倍,具有良好的筛选分辨率;随后构建了α-1,3-FucT的随机及半理性设计突变库,通过3轮定向进化获得了对天然底物N-乙酰乳糖胺(LacNAc)和非天然底物乳糖(Lactose)的催化活性分别提高5倍和8.5倍的突变体3S7(S45F/D127N/R128E/H131I/Y199N/E340D/V368A);进一步对3S7的突变位点在α-1,3-FucT的晶体结构中分布进行考察发现,大部分突变位点都位于受体底物结构口袋附近,为进一步揭示底物结合及催化机制提供了线索。在此基础上我们用类似的方法设计了幽门螺杆菌α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)的两种不同结构、不同基团的荧光受体底物,开发了α-1,2-FucT的FACS筛选方法,这不仅拓展了单细胞超高通量筛选方法的应用空间,而且为糖基转移酶的大范围改造奠定了基础。