前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一，在美国占老年男性肿瘤发病率首位，在国内,随着寿命的延长和生活方式的改变，其发病率也在增长，已成为严重威胁男性健康和生命安全的重要疾病。传统的前列腺癌治疗方法包括手术、激素治疗、化疗和放疗等。手术治疗只能针对早期发现并身体条件允许的病人；大多数化疗药物缺乏对肿瘤组织的高选择性，在对肿瘤发生作用的同时也会对正常组织产生严重的毒副作用；激素治疗后2～3年，肿瘤常以非激素依赖的形式复发。因此，寻找新的治疗前列腺癌的方法具有十分重要的意义。　　抗体导向酶-前体药物治疗(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)就是一种正在研究和完善的治疗方案。该方法利用针对肿瘤抗原的特异性抗体作为载体，携带前体药物的专一性活化酶，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内被抗体所携带的酶转化为活性细胞毒分子，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。ADEPT自1987年问世以来，受到广泛关注。用于治疗结肠癌的羧肽酶G2系统已经进入了临床Ⅱ期试验，在结肠癌的治疗研究中显示出较好的疗效和应用前景。其他ADEPT方案，如β-葡糖苷酸酶系统、青霉素酰胺酶系统、胞嘧啶脱氨酶系统等也都在进行研究和改进。　　本实验室应用羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)针对前列腺癌的ADEPT疗法的研究已经进行多年，具有良好的研究基础。合成了两种前体药物氨甲喋呤-α-肽衍生物：氨甲喋呤-α-苯丙氨酸（MTX-α-Phe）和氨甲喋呤-α-精氨酸（MTX-α-Arg）。体外细胞细胞毒试验表明，经CPA1水解后，MTX-α-Phe转化为MTX，其细胞毒活性大于前体药物约1000倍。用抗人精浆蛋白单克隆抗体-CPA交联物（E4B7McAb-CPA）进行前列腺癌动物模型的体内试验，抑瘤率达87.6％。CPA1系统对与前列腺癌治疗的试验研究已取得一定进展，但在研究过程中我们发现将其运用于临床还存在一些问题。由于CPA1分子量较大，①抗体-酶交联物不易进入实体瘤；②酶与抗体基因融合后，表达困难，较难获得有活性且具备一定量的融合蛋白。本实验室根据文献报道，克隆并表达了只有CPA1全酶一半分子量的活性中心，其分子量相对较小，但活性较低，不能完全满足实验需求。　　为寻找分子量较小但活性较强的最佳水解酶，我们拟建立CPA1的肽段库，从中筛选具有较高酶活性的肽段。要进行筛选，寻找合适的活性酶表达载体和建立合适的酶活性筛选方法是其关键。前期试验中使用原核和酵母细胞表达CPA1和活性中心，虽都有活性，但均须进行纯化、复性等步骤后才能产生活性，过程较为复杂，不适宜作为筛选方法。　　pFLAG-CMV-1是哺乳动物细胞分泌表达载体，可在哺乳动物细胞（尤其是COS细胞）瞬时性高分泌表达目的基因，而且哺乳动物细胞比原核和酵母细胞有着更完善的蛋白表达体系，更易于得到有活性的目的蛋白；此外表达的目的蛋白氨基端融合了FLAG-tag（6肽），此标签方便了表达产物的检测。因此，用COS-7细胞分泌表达目的蛋白可以为CPA1活性肽段的筛选提供合适的酶活性测定载体。　　本研究分泌表达了CPA1全酶及其4条肽段，并建立检测表达产物水解活性的方法，为下一步大规模筛选奠定基础。在实验中，我们以胰腺总RNA为模板，RT-PCR扩增CPA1全酶基因（长1209bp）；再以全酶基因为模板，PCR扩增其4条肽段基因（其中肽段A基因为根据计算机模拟的CPA1活性中心基因，长630bp；肽段B基因为活性中心及其上游102bp基因，长732bp；肽段C基因为活性中心及其下游108bp基因，长738bp；肽段D基因则为包括活性中心、其上游102bp和下游108bp在内的基因，长840bp）；扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAG-CMV-1中构建重组载体；然后用脂质体转染COS-7细胞，分泌表达融合FLAG-tag的目的蛋白；DotBlot法检测到细胞培养上清中有目的蛋白的表达；用底物马尿酰苯丙氨酸和MTT法测定表达产物水解酶活性显示：CPA1全酶有较好的水解活性，与CPA1商品活性相当，肽段中A（活性中心）有部分水解活性，为全酶50％左右，与本实验室以前实验结果相同；肽段C与A活性相当，但肽段B和D则无活性。　　CPA蛋白结构与功能的关系表明，全酶由外围9个α-螺旋构成的桶样亲水结构包绕一个由9个β-片层组成的大β-片层基序构成，其中α-螺旋构成的桶样亲水结构是大β-片层基序存在的基础，而β-片层形成特征性扭力使酶蛋白结构保持活性状态。我们通过Swiss-Port数据库检索CPA1分子结构发现，活性中心上游102bpDNA翻译后为β-片层结构，而活性中心下游108bpDNA翻译后则为α-螺旋结构。据此，结合全酶和各肽段活性我们推测：①肽段A（活性中心）有部分酶活性，说明活性中心所具有的α-螺旋能形成亲水结构包绕β-片层基序，而且此部分β-片层基序也能够维持其特征性扭力而保持酶活性，两者处于相对平衡状态。但因活性中心缺少其他功能基团的辅助只能表现约全酶一半的活性；②肽段C比活性中心在羧基端多一个α-螺旋结构，但两者活性相当，说明此段α-螺旋对亲水结构形成的贡献不大，不影响酶活性；③肽段B和D无活性，二者结构上与活性中心相比均在氨基端多出一个β-片层结构，推测此段β-片层可能影响活性中心所形成的β-片层基序结构的特征性扭力，不能使酶蛋白保持活性结构而失活，说明此β-片层对活性中心影响很大。这些推测有待于进一步验证。　　综上所述，本研究中COS-7细胞能分泌表达有活性的目的蛋白，直接用转染细胞培养上清检测表达产物水解活性是可行的，为筛选分子量较小但活性较强的最佳水解酶奠定了基础。