前言：　　胃癌(GC)是一个重要的全球卫生问题，并且是第四最常见的恶性肿瘤，而发病率和死亡率居世界第二。越来越多的研究表明，胃癌的发生发展与表遗传学密切相关，尤其是组蛋白修饰和DNA甲基化，并且基因启动子甲基化常与H3K9甲基化共同调控基因转录。随着芯片技术日新月异的发展，基因芯片应用的领域更为广泛，有研究曾应用CGI微阵列芯片配合H3K9甲基化和乙酰化抗体来识别表遗传学沉默的目标基因，得到了良好效果。我们团队之前的研究也使用这种芯片技术于胃癌细胞株中进行筛选，发现基因NLK(Nemo-like kinase)很可能在胃癌中存在表观遗传沉默现象，所以就此进行了全面系统的研究。　　NLK基因是学者研究红鳍东水魨神经纤维瘤病1型基因时在其5非编码区偶然发现的，其与Nemo基因相似，所以命名为Nemo-like kinase。NLK分两个亚型即为NLK1和NLK2。NLK1主要存在于爪蟾和斑马鱼中;NLK2主要存在于包括鼠类和人类在内的许多不同物种，所以下文提及的NLK实为NLK2。研究表明NLK定位主要为细胞核，在成人大脑中呈高表达水平，而在心、肾、肝和肺脏器中呈稳定的低表达状态。NLK在很多信号通路中发挥作用，但最为重要的是Wnt通路。研究证明，NLK能够通过负向调控经典的Wnt/β-catenin途径影响肿瘤的发生、发展。　　一些独立研究发现NLK基因在前列腺癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、结肠癌及神经胶质瘤等存在表达下调现象，并与肿瘤的发生发展密切相关。但是，NLK在胃癌中表达以及功能情况尚不清楚。　　目的：　　本研究首先检测NLK在胃癌中的表达情况，探讨其与胃癌的发生、发展、转移及临床病理学的关系，进一步研究其分子调节机制，探讨研究结果是否可以为临床提供新的治疗思路。第一部分，本部分研究首先检测了胃癌细胞NLK的表达水平，然后检测NLK启动子基因甲基化及H3K9甲基化与乙酰化水平，从而分析胃癌细胞系中NLK表达水平与DNA甲基化及H3K9甲基化与乙酰化的关系;第二部分，本部分研究首先通过体外实验研究应用去甲基化制剂与去乙酰化制剂作用于胃癌细胞株，观察NLK表达水平变化，然后检测NLK启动子基因甲基化及H3K9甲基化与乙酰化水平变化，进一步分析这些变化与药物干预间存在的关系;然后应用siRNA技术沉默NLK高表达胃癌细胞株，检测其增殖和侵袭能力的变化情况，并应用Western blot技术检测NLK基因沉默后NLK蛋白与β-catenin蛋白水平变化及二者的关系;第三部分，本部分研究首先检测胃癌组织与配对正常组织中NLK基因的mRNA表达水平及蛋白表达水平，然后检测其NLK启动子区基因甲基化水平，分析胃癌组织与配对正常组织中NLK表达水平及甲基化水平的关系，并进一步探讨NLK表达下调机制及其与临床病理学资料的联系，然后联系第二部分药物干预结果，由此探讨5-Aza-dC药物对NLK基因表达调控的意义及在胃癌临床治疗中的潜在临床应用价值。　　方法：　　一、实验对象　　选择2009年4月～2010年6月中国医科大学肿瘤研究所行手术切除且病理组织学检查确诊为胃癌的标本40例;人胃癌细胞株BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和胃粘膜永生化细胞株GES1.　　二、实验方法　　1、细胞培养:BGC823、SGC7901、AGS、MKN45和GES1按常规培养。　　2、qTR-PCR分别检测NLK基因mRNA在组织和细胞水平中的表达情况。　　3、Western blot检测胃癌和癌旁组织中NLK蛋白表达含量，并检测BGC823细胞株NLK基因沉默后NLK蛋白与β-catenin蛋白水平变化。　　4、MTT法检测转染至BGC-823细胞NLK表达沉默后细胞活力变化。　　5、划痕实验与Transwell侵袭实验检测转染致BGC-823细胞NLK表达沉默后细胞迁移与侵袭能力变化。　　6、甲基化特异性PCR法检测NLK启动子基因甲基化状况;免疫共沉淀PCR法检测NLK基因DNA启动子区H3K9甲基化与乙酰化状态。　　7、应用去甲基化与去乙酰化制剂干预BGC823胃癌细胞株，检测干预前后NLK基因表达、启动子甲基化状态及H3K9甲基化状态变化情况。　　结果：　　第一部分胃癌细胞系中NLK表达与DNA甲基化及H3K9甲基化和乙酰化关系的研究　　1、qRT-PCR结果显示，NLK表达水平在4株胃癌细胞株与1株正常人胃粘膜永生化细胞株相比，均低于胃粘膜永生化细胞株GES1(P＜0.01)。然而，NLK于BGC823中的表达高于MKN45与SGC7901，低于AGS。　　2、甲基化特异性PCR检测4株胃癌细胞株与1株胃粘膜永生化细胞株中NLK基因启动子甲基化情况，MKN45、BGC823显示其启动子区甲基化;SGC7901为半甲基化，而AGS与GES1则显示非甲基化。　　3、免疫共沉淀PCR法检测发现NLK基因在胃癌细胞系SGC7901，BGC823及MKN45中，NLK基因启动子区H3K9甲基化与DNA的甲基化正相关，即DNA甲基化程度高者，H3K9甲基化程度也高;半甲基化者，H3K9甲基化程度中等;无甲基化者，H3K9甲基化程度很低;而H3K9乙酰化与DNA的甲基化负相关。　　4、对4株胃癌细胞株应用甲基化酶抑制剂5-Aza-dC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理72h。结果显示单用5-Aza-dC可明显提高NLK表达水平，而TSA单独作用对NLK的表达影响不明显。联合应用5-Aza-dC和TSA可使NLK的表达水平稍高于单用5-Aza-dC。　　5、甲基化酶抑制剂5-Aza-dC可使NLK启动子区H3K9甲基化水平降低，而乙酰化抑制剂对其无影响。而且，5-Aza-dC也可使H3K9甲基化状态降低，H3K9甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用。　　第二部分胃癌细胞中NLK表达下调对胃癌细胞增殖侵袭转移能力影响的研究　　1、选取NLK相对高表达的胃癌细胞株BGC823，采用NLK特异干扰质粒沉默其表达后，NLK的mRNA及蛋白表达水平明显下降，然而β-catenin蛋白表达水平明显升高。　　2、转染致胃癌细胞株BGC823中NLK基因沉默后，其增殖率明显变强。　　3、转染致胃癌细胞株BGC823中NLK基因沉默后，其侵袭与迁移能力均明显增强。　　第三部分胃癌组织中NLK基因mRNA表达及DNA甲基化状态的临床意义的研究　　1、40例胃癌组织中NLK基因mRNA表达水平明显低于配对的癌旁组织。胃癌组织NLK基因mRNA表达水平与浸润深度和淋巴结转移情况密切相关(P＜0.01);而与组织分化程度、性别、年龄、肿瘤部位、大小、临床病理分期等资料无明显关联(P＞0.05)。　　2、胃癌组织的Western blot结果证实NLK蛋白表达水平明显低于配对的癌旁组织(P＜0.01)。　　3、40例胃组织中，癌组织的甲基化水平明显高于配对的癌旁正常组织，差异显著(P＜0.01)，胃癌组织DNA甲基化与浸润深度和淋巴结转移情况密切相关(P＜0.01)，而与其它临床病理学特征无明显关联(P＞0.05)。　　结论：　　1、NLK在胃癌细胞株和组织均呈现表达水平下调，且与胃癌淋巴结转移及浸润深度密切相关。　　2、NLK表达水平下调可以增强胃癌细胞的增值和侵袭转移能力。　　3、NLK启动子区CpG岛的DNA异常甲基化与相应区域组蛋白H3K9甲基化是胃癌细胞及组织中NLK表达水平下调的主要机制。　　4、5-Aza-dC可以降低NLK启动子区CpG岛的DNA甲基化与相应区域组蛋白H3K9甲基化水平，并可以提高胃癌细胞株中NLK的表达水平。