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第一部分:APE1乙酰化调节电离辐射诱导的Hela细胞自噬研究背景:放射治疗是晚期肿瘤主要的治疗手段,但放疗抵抗的现象普遍存在。APE1/Ref-1,DNA损伤修复和氧化还原(redox)双功能基因,作为提高放射治疗敏感性的靶点已经被广泛证实,但具体机制还在探索中。APE1是一个多功能蛋白,具有氧化还原一些转录因子(如P53、AP-1、PTEN、NF-kb等)和DNA碱基损伤修复的功能。乙酰化、磷酸化、泛素化都是APE1翻译后修饰的方式,但APE1乙酰化修饰尤为重要。APE1的N末端有多个位点能被乙酰化转移酶修饰,尤其K6/K7位点的乙酰化修饰与APE1多种活性密切相关,如与n Ca RE序列、YB-1介导的MDR1基因激活和BER功能密切相关。自噬是细胞的一种适应性反应,应激刺激时细胞自我吞噬和降解细胞内的长寿蛋白和细胞器,从而维持细胞存活。细胞自噬与肿瘤的发生、发展、治疗存在密切的关系。为了探索APE1乙酰化与电离辐射(Ionizing Radiation IR)诱导的细胞自噬之间的关系,我们利用IR处理,观察Hela细胞APE1乙酰化水平、细胞自噬水平的变化及可能的机制,为APE1作为放射治疗的的靶点提供进一步的理论依据。研究目的:探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶?氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)乙酰化对电离辐射诱导Hela细胞自噬的调节作用。研究方法:给予Elekta precise直线加速器处理Hela细胞0、2、4Gy照射24小时,或2Gy照射0、6、24、48小时后,应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的方法检测APE1乙酰化修饰及Beclin1/Bcl2的结合,流式细胞仪检测细胞自噬的水平,免疫荧光激光共聚焦检测LC3的聚集,Western blot检测APE1、LC3和p62的表达。研究结果:Hela细胞APE1乙酰化水平随着照射剂量的增加和照射后时间的延长而逐渐升高(P<0.05)。Hela细胞LC3Ⅱ的表达与照射剂量正相关,而与P62呈负相关(P<0.05);电离辐射促进细胞的自噬水平和LC3的聚集。电离辐射后,LC3Ⅱ上调;与对照组APE1WT相比,APE1K6R/K7R细胞Beclin1/Bcl2结合增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,P62表达上调(P<0.05)。结论:APE1乙酰化通过Beclin1/Bcl2途径调节电离辐射诱导的Hela细胞自噬。第二部分:genistein调节Beclin1依赖的细胞自噬促进放疗敏感性研究背景:放射治疗最近把提高辐射精度,降低肿瘤发病率,减少对肿瘤组织剂量不足和对正常组织剂量过大机率考虑在内。为了更好达到肿瘤治疗的目的,放射治疗的辅助用药应运而生。Genistein是黄豆天然产物大豆异黄酮的主要成分,一些体内体外研究证实,在前列腺癌,乳腺癌,结肠癌,胃癌,肺癌,胰腺癌,淋巴瘤中具有明显的抗肿瘤效应。Genistein明显的提高肿瘤放射治疗的疗效,也能减轻放射治疗对正常组织引起的炎性损伤。Genistein能够提高化学治疗诱导的细胞凋亡和自噬水平,其具体机制还不清楚。Bcl-xl是bcl2家族的成员,与bcl-2蛋白均是抗凋亡蛋白的成员之一,bcl-xl在肺癌细胞中表达高于bcl-2。Bcl-xl的在前列腺癌细胞中的高表达和下调直接影响pc-3细胞对治疗的敏感性。Bcl-xl与线粒体稳定的结合,抑制凋亡蛋白与线粒体的结合而抑制凋亡的发生;bcl-2家族抗凋亡蛋白定位于细胞核,主要是通过下调碱基切除修复酶APE1并与DNA修复酶APE1、XRCC1、c-Myc等相互结合抑制酶的活性抑制碱基切除修复。大量研究证实,Genistein抑制肿瘤细胞G2/M期促进细胞凋亡的发生[1,2],也促进肺部肿瘤放射治疗和化学治疗诱导的细胞自噬水平。Bcl-xl蛋白主要定位在线粒体膜,维持线粒体的稳定、阻止细胞色素C的释放和caspase蛋白的激活,发挥抗凋亡的功能。现在证据表明bcl-xl蛋白也定位在内质网,细胞核,并发挥一定的功能。Bcl-xl和Beclin1之间通过BH3区域相互结合组成的复合物是自噬调控的一个开关。自噬是一个细胞自我分解的过程,细胞把要降解和循环利用长寿蛋白和细胞器吞入溶酶体进行降解,降解的细胞器有线粒体,过氧化物酶体,内质网。在机体处于饥饿和应激的正常情况下,自噬是有利于细胞存活的;但是越来越多的证据表明自噬过度刺激或始终激活,自噬也是促进细胞死亡的程序。细胞自噬水平的过高或过低都不利细胞存活,许多抗肿瘤治疗大多是诱导自噬发生。细胞凋亡调节的紊乱可在治疗抵抗的肿瘤中普遍存在,几乎所有的肿瘤都能维持凋亡的核心调控机制。Genistein促进肿瘤治疗诱导的凋亡水平,单用和联用genistein明显的抑制细胞浆内的bcl-xl的蛋白量。对于bcl2抗凋亡家族蛋白高表达的肺部肿瘤,genistein通过多种机制促进凋亡的发生。抗凋亡蛋白bcl-2家族与Beclin1结合发挥抗自噬活性,也是维持细胞存活的途径。改变抗细胞调往的bcl-2家族蛋白的入核情况和与Beclin1之间结合是诱导细胞自噬性凋亡的机制之一。研究目的:探索Genistein引起NSCLC细胞中Bcl-xl亚细胞定位的改变与IR诱导的细胞凋亡、自噬之间的关系,为提高放射治疗敏感性、减轻放射治疗损伤反应提供可靠的辅助手段。研究方法:利用细胞浆细胞核蛋白提取试剂盒分别提取核浆蛋白;通过western Blot的方法检测各种凋亡自噬标志蛋白表达;用免疫荧光的方法检测A549细胞Bcl-xl亚细胞定位的改变;流式细胞仪是在细胞水平检测凋亡和自噬水平。研究结果:肺癌细胞系胞浆Bcl-xl蛋白含量的差异影响IR诱导的细胞DNA损伤修复和细胞抗凋亡能力;Genistein改变A549细胞Bcl-xl蛋白的亚细胞定位,抑制IR诱导DNA损伤修复,促进Bcl-xl/Beclin1复合物的解离提高细胞的自噬水平,促进Bcl-2家族相关的多重凋亡途径,而且NSCLC胞浆Bcl-xl表达水平与放射治疗后ORR(Objective response rate)明显相关。结论:总之,我发现,genistein改变bcl-xl核浆亚细胞定位,抑制放射治疗诱导DNA损伤修复,启动bcl-2家族相关的线粒体凋亡途径,促进bcl-xl/Beclin1复合物的解离提高细胞自噬水平,从而激活放射治疗诱导的多重凋亡机制。