【摘 要】
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菱角作为我国民间一种药用佳果已有几千年的历史,其壳具备药用价值。灵芝是一种食药用真菌,具有非常广泛的药理活性。将灵芝作为发酵菌种进行微生物转化,可促进中药材减毒和增加有效成分,提高药材活性。本课题通过单因素结合响应面实验,优化灵芝固态发酵菱角壳工艺;制备发酵前纯化多糖（P1）及发酵纯化多糖（P2）,并进行表征对比分析;制备发酵前后的醇提物（AE1、AE2）,比较AE1、AE2中多酚类、黄酮类等活性
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菱角作为我国民间一种药用佳果已有几千年的历史,其壳具备药用价值。灵芝是一种食药用真菌,具有非常广泛的药理活性。将灵芝作为发酵菌种进行微生物转化,可促进中药材减毒和增加有效成分,提高药材活性。本课题通过单因素结合响应面实验,优化灵芝固态发酵菱角壳工艺;制备发酵前纯化多糖（P1）及发酵纯化多糖（P2）,并进行表征对比分析;制备发酵前后的醇提物（AE1、AE2）,比较AE1、AE2中多酚类、黄酮类等活性物质含量,并采用UPLC-QTOF-MS/MS技术解析其成分;以小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）为考察对象,对比分析发酵前后多糖激发免疫活性的能力以及醇提物抗氧化活性的差异。主要结果如下:（1）响应面优化灵芝发酵菱角壳最佳工艺为:紫芝发酵,发酵时间2 d,发酵温度为14℃、湿度75%。最佳工艺所得水提物得率为4.355±0.01613%,DPPH自由基清除率为82.3592±0.05918%。（2）灵芝发酵后菱角壳粗提物总多糖含量为18.484±0.090%,较发酵前（9.810±0.364%）有显著提高（P＜0.05）,P1的不同重均分子质量的级分比例较为平均,P2的主要级分的重均分子质量集中于2.019×10~5±1.112 u。P1、P2的平均分子质量分别为6.004×10~6u、7.812×10~4u。P1由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖7种单糖组成,P2较P1增加了鼠李糖、木糖,二者主要组分均为葡萄糖分别占86.817%（P1）、63.191%（P2）。扫描电镜（SEM）可见P1呈均匀的颗粒状,P2呈晶体状状。傅里叶红外（FT-IR）分析表明:P2较P1多糖骨架的“CH2”振动强度有强化,酰胺I峰明显往低波数方向偏移,且由P1的β-折叠酰胺I峰变为无规则酰胺I峰,羟基振动强度也有所增大。P1、P2均具有三螺旋结构,P2含量更高。（3）与AE1相比,AE2部分多酚、黄酮等活性物质含量均有上升趋势。UPLC-MS/MS分析表明,AE1部分共有58种物质,AE2部分有63种物质。AE2的主要活性成分为:鞣花酸、1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖、柚皮苷、柚皮素、没食子儿茶素、吲哚、灵芝醇A等。对比AE1的主成分,新增了没食子儿茶素、木犀草苷、灵芝醇A等物质,减少了杨梅素、麦芽酚、6-姜酚等物质。发酵后,新生成的次生代谢产物为金缕梅单宁、乔松素、白烨脂酸、β-乳香酸、3-表齐墩果酸、山腊梅碱、脱水长春碱、野芝麻新苷;桑皮酮H、阿江榄仁酸、月桂烯发酵后消失。（4）P1、P2刺激均可显著提高RAW264.7细胞中NO、i NOS、TNF-α、IL-2、IL-10等促炎因子的分泌,刺激免疫活性,而P2效果更佳。P1、P2均可显著上调NF-кB通路中p50、p52、p65基因的表达,同时下调p100、ikkα的表达量,且P2明显强于P1。AE1、AE2处理后RAW264.7的T-AOC和T-SOD分泌量均显著上升,MDA分泌量显著下降,AE2较AE1效果更为明显。AE2能显著提高Nrf2/Keap1-ARE通路中gpx2、gpx5、gclc、gclm基因m RNA的表达量,并可显著下调keap1的表达量;AE1仅对gpx2、gpx5、gclc基因的表达具有上调效果。灵芝发酵菱角壳,可提高多糖部分的激发免疫活性的能力,其作用与NF-кB通路有关;还可明显提高醇提物的抗氧化能力,其作用与Nrf2/Keap1-ARE通路有关。
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