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膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤,具有发病率高、复发率高等临床特点。膀胱粘膜局部免疫功能低下,是使残存瘤细胞逃逸免疫监视、得以生存、发展形成复发的重要原因之一。如何提高膀胱肿瘤患者的免疫功能成为治疗和预防膀胱肿瘤复发的关键。BCG膀胱灌注是治疗膀胱肿瘤和预防其复发最有效的方法之一,BCG联合IL-2治疗膀胱肿瘤具有更好的临床疗效,但无论是BCG还是IL-2在临床治疗膀胱癌均存在着剂量大、疗程长、毒副作用大等缺点。因此,探讨更为有效、安全的免疫疗法对膀胱肿瘤治疗及预防复发具有重要意义。Ag85B是BCG、结核杆菌及其它分枝杆菌最主要的分泌蛋白,是BCG在体外和体内发挥生物学作用的主要成分,也是广泛分布于结核杆菌以及其它非典型分枝杆菌中具有交叉反应性的蛋白,能够诱导机体强烈的Th1免疫反应。利用分枝杆菌Ag85B的免疫原性,除可在制备预防结核的多肽疫苗和基因疫苗中发挥作用外,在膀胱肿瘤及其它肿瘤治疗中的应用研究近年来受到重视。本研究运用基因重组技术,将结核杆菌Ag85B基因与人IL-2cDNA进行连接,构建Ag85B/IL-2融合基因,并进行原核表达和纯化,获得Ag85B/IL-2融合蛋白,研究Ag85B/IL-2融合蛋白在体内外对膀胱肿瘤的免疫治疗效应,为其进一步的开发和应用奠定基础。主要研究内容及结果如下:1.结核杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白表达载体的构建和原核表达⑴ 首先采用PCR的方法,以质粒pUC18/Ag85B为模板,扩增结核杆菌Ag85B基因,通过限制性内切酶EcoRI和KpnI位点使其定向插入到克隆载体pUC18中,命名为pUC-Ag85B。再以质粒pCIIL-2为模板扩增不含信号肽的人IL-2编码基因,通过限制性内切酶KpnI和BamHI位点使IL-2 cDNA定向克隆到pUC-Ag85B中,以编码连接子(Linker)Gly4Ser1的碱基序列连接于Ag85B基因下游,构建克隆质粒pUC-Ag85B/IL-2,酶切鉴定和序列测定证实Ag85B/IL-2融合基因符合设计要求。⑵ 将Ag85B/IL-2融合基因亚克隆入三种不同的原核表达质粒pGEX4T-1、pThioHis、pBV220,构建三种表达载体pGEX-Ag85B/IL-2、pTHio-Ag85B/IL-2和pBV-Ag85B/IL-2,限制性内切酶切鉴定显示构建正确。将三种表达质粒分别转化大肠<WP=15>杆菌BL21、DH5α和Top10,成功构建基因工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2、Top10/ pTHio-Ag85B/IL-2和DH5α/ pBV-Ag85B/IL-2。⑶ IPTG诱导基因工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2和Top10/ pTHio-Ag85B/IL-2表达,42℃温控诱导DH5α/ pBV-Ag85B/IL-2表达,SDS-PAGE分析表达结果。结果显示:工程菌BL21/ pGEX-Ag85B/IL-2成功表达出大小约66kD的蛋白,与GST-Ag85B/IL-2融合蛋白理论大小近似,表达量占菌体总蛋白的31%。用兔抗人IL-2单克隆抗体行Western blot,此蛋白条带呈阳性,间接证实了表达的蛋白为GST-Ag85B/IL-2融合蛋白。其余两种基因工程菌未能表达出目的蛋白。⑷ 对GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的表达条件进行了优化, 37℃ IPTG诱导下,融合蛋白的表达量在5～6h达高峰;0.1～1.5mmol/L IPTG浓度范围内融合蛋白表达量没有明显差异。故确定表达条件为0.1mmol/L IPTG,37℃,诱导时间5～6h。蛋白表达鉴定结果显示融合蛋白主要以包涵体形式产生。2.Ag85B/IL-2融合蛋白的纯化⑴ 大量表达并分离GST-Ag85B/IL-2融合蛋白包涵体,用8mol/L尿素溶解,并采用梯度浓度尿素对包涵体成功进行透析复性。⑵ 将包涵体复性液上样于GST-Sepharose 4B亲和层析柱,以GSH洗脱液洗脱,收集主峰行SDS-PAGE电泳,结果证实主峰中含有初步纯化的GST-Ag85B/IL-2融合蛋白,分子量约为66kD,与预期结果相符,但仍有部分杂蛋白,表明有部分蛋白发生了非特异性吸附。将亲和层析后的样品溶液中加入凝血酶,室温下作用5h,行SDS-PAGE电泳,结果证实融合蛋白大部分被切开,酶切后出现了66kD、45kD、26kD三条主要蛋白条带。 ⑶ 融合蛋白的凝血酶裂解产物上样于Q Sepharpse Fast Flow层析柱行阴离子交换层析,收集主峰蛋白行SDS-PAGE电泳,结果证实主峰主要为切掉GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,分子量约为45kD,纯度明显提高,但仍有少量杂蛋白。⑷ 进一步行RP-HPLC纯化获得纯度为98.32%的目的蛋白,N末端氨基酸序列测定与预期的Ag85B/IL-2融合蛋白完全一致。3.Ag85B/IL-2融合蛋白在体外对膀胱肿瘤细胞的免疫抑制效应⑴ 利用CTLL-2株,MTT法检测Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2比活性,结果为2500 u/mg。⑵ MTT法检测Ag85B/IL-2融合蛋白对人PBMC增殖的影响,结果表明:当Ag85B/IL-2融合蛋白刺激浓度小于0.8ug/ml时,随着刺激浓度的增加,PBMC的增殖<WP=16>水平也增加,以0.8ug/ml浓度时作用72h时达最高,继续增高刺激浓度和延长作用时间,PBMC的增殖水平不再升高。⑶ ELISA法检测Ag85B/IL-2融合蛋白作用PBMC后Th1型细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平,结果以0.8ug/ml的浓度刺激PBMC 72h时,IL-12的分泌达最高;IFN-γ水平在各种浓度Ag85B/IL-2融合蛋白刺激后, 72h内缓慢上升,72h后则快速上升,其中以1.6ug/ml的刺激浓度作用96h时,IFN-γ水平达最高。Ag85B/IL-2融合蛋白刺激PBMC 72时, IL-12和IFN-γ分泌水平均显著强于Ag85B、IL-2、Ag85B+IL-2和BCG。⑷ MTT法检测Ag85B/IL-2融合蛋白激活的PBMC对膀胱肿瘤细胞株BIU-87、T24、E-J和BTT739的细胞毒作用。