以微生物脂肪酸为原料制备生物柴油具有良好的应用前景,然而分离纯化过程成为影响脂肪酸产品成本和纯度的重要瓶颈问题。探索脂肪酸的胞外分泌机制,成为微生物细胞改造,促进微生物脂肪酸合成生物柴油等绿色能源的基本科学问题。本研究利用蛋白质组学技术(双向电泳)和转录组学技术(RNA-Seq)在细胞整体水平上解析了敲除脂酰辅酶A合成酶基因的酿酒酵母突变菌株和酿酒酵母原始菌株在脂肪酸分泌的不同时期蛋白质和RNA表达的差异;分析了敲除酿酒酵母菌脂酰辅酶A合成酶基因对整体调控、细胞代谢、分泌机制的影响;总结出酿酒酵母菌脂肪酸胞外分泌假想机制。主要研究结果如下:(1)蛋白质样品制备是双向电泳的关键步骤,细胞破碎效果、裂解液中的蛋白溶解度、蛋白的修饰和降解等因素将直接影响到2-DE的准确度和重复性。本文比较了六种酿酒酵母全蛋白制备的方法,以蛋白释放率、全蛋白浓度为指标确定玻璃珠为最好的破碎方法;从破碎次数、玻璃珠用量、装液比三方面对玻璃珠破碎方法进行正交试验优化,得到了制备酿酒酵母提取全蛋白的最佳条件为:50 mg干重的酿酒酵母菌体,1 mL裂解液,玻璃珠1 g,装液比20%,涡旋振荡30 s,冰浴30 s,重复以上操作60次。蛋白释放率达到了 9.23%,蛋白浓度1.21 g/L。(2)要分析突变菌株和原始菌株在细胞生长的不同时期、脂肪酸分泌的不同时期蛋白质和RNA的差异,首先需要确定两菌株脂肪酸分泌表型的正确性,通过气相色谱的方法得出YB526无论是在总的脂肪酸分泌量还是在各个时期胞外脂肪酸产量上都高于YB332,证明它们分泌脂肪酸的表型是正确的。通过两株菌株脂肪酸分泌图我们可以得出YB332收集对数期发酵液的时间点是26h,YB526收集对数期和稳定期发酵液的时间点分别是30 h和80 h。(3)采用蛋白质组学技术和转录组学技术结合的方法,分析比较了突变菌株和原始菌株在对数期和稳定期蛋白质和RNA表达水平的差异,总结出酿酒酵母菌脂酰辅酶A基因缺失菌株YB526由于脂肪酸的积累,导致了一系列的细胞响应。首先,氨基酸(谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸)通过耐酸系统来减少脂肪酸带来的有毒影响。其次,细胞膜中的神经酰胺和麦角固醇含量的减少可以提高膜的渗透性,加强游离脂肪酸运输到胞外。第三,在脂酰辅酶A缺失菌株YB526中,由于脂肪酸的毒性,14-3-3蛋白的增加不能提高麦角固醇的生物合成。(4)差异基因和蛋白表达谱表明,突变菌株中膜确实发生了变化,总结出酿酒酵母菌脂肪酸胞外分泌的假想机制。首先,细胞膜的外排泵可以将脂肪酸排出。其次,细胞膜中麦角固醇和神经酰胺含量的降低能提高膜的渗透能力和脂肪酸的分泌。