继发性脊髓损伤(secondary spinal cord injury,SSCI)是脊髓损伤后一个重要而独特的病理过程,而空洞的形成是其重要病理现象之一。空洞由原始创伤灶逐渐扩大而形成,并最终稳定,空洞周围始终伴有以反应性星形胶质细胞为主的胶质瘢痕,且炎症反应在此过程中也起重要作用,而在此过程中星形胶质细胞、小胶质/巨噬细胞死亡机制及其是否参与空洞扩大尚不清楚。神经元凋亡曾被认为是空洞形成的主要原因。脊髓损伤后,神经元凋亡在时空分布上表现为两个高峰。损伤后24小时出现第一个高峰,凋亡细胞主要位于损伤区中心;损伤后1周左右出现第二个高峰,凋亡神经元主要分布于损伤区周围。后来的研究发现,在损伤后1周到1月,损伤区周围白质中的少突胶质细胞发生AMPA受体介导的凋亡,被认为也参与空洞扩大的过程。然而,脊髓损伤后给予凋亡拮抗剂并不能有效地阻止空洞的扩大。我们前期的研究结果也显示,Caspase-3敲除小鼠脊髓损伤后并未显示出空洞大小的减轻及显著改善的行为学恢复。以上结果提示,可能还有其它形式或(及)种类的细胞死亡,其在脊髓损伤后空洞扩大的过程中起重要作用。细胞可经凋亡、自噬和坏死三种主要方式死亡,其中有关凋亡和自噬的研究目前已比较成熟,参与凋亡和自噬的分子机制也较清楚,调控相关分子可控制凋亡和自噬的发生。脊髓损伤后神经元、少突胶质细胞也可发生自噬,但相对于凋亡而言,数量较小。而对于坏死,传统认为其是一种被动的、急性的、不可调控的细胞死亡,表现为细胞膜完整性丢失,细胞器肿胀,线粒体功能障碍,无典型凋亡和自噬的特征如核固缩和自噬小体的形成等。脊髓损伤后,通常认为坏死发生于损伤急性期,且不可逆转,至今很少有相关的机制性研究。近年的研究发现存在着一种由rip1/3及mlkl介导的形态特征上介于凋亡和坏死的细胞死亡,即程序性坏死(necroptosis),提示坏死是可调控的过程。该途径的胞外死亡信号中,目前研究最清楚的是tnfα,激活tnf受体后,与胞内相关分子结合并激活rip1的激酶活性,rip1进而磷酸化rip3并与之形成坏死小体(necrosome),后者再磷酸化mlkl,而pmlkl发挥其改变生物膜通透性的作用,引起ca2+超载继而促进细胞necroptosis。坏死小体的形成处于该途径的中心位置,其中rip3的表达及其磷酸化水平的升高与细胞坏死的发生高度相关。目前已发现在心脏、肾脏、肝脏的多种病理条件下多种细胞均可发生不同程度的necroptosis,并在一些难治性疾病的进展中起关键作用,如胰腺炎、结核、动脉粥样硬化。抑制rip1和rip3的活性可有效地减轻细胞necroptosis,为上述疾病的治疗带来了新的希望。深入研究necroptosis的分子机制及保护措施已成为目前国际细胞死亡领域一个新的热点和趋势。脊髓损伤后空洞扩大的过程中是否有necroptosis发生,尚未见相关研究;作为瘢痕组织的主要组成部分,胶质细胞在sci后如何被去除及其是否参与空洞扩大也值得研究。探讨脊髓损伤后胶质细胞的死亡机制对于深入理解继发性损伤及功能保护至关重要。于是我们设计如下实验,研究脊髓损伤后空洞扩大过程中胶质细胞死亡的机制及保护研究。本研究由以下六部分实验组成:第一部分:小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞的死亡方式研究本部分实验通过建立小鼠脊髓夹伤模型,研究脊髓损伤后空洞扩大过程的动态变化,及空洞周围星形胶质细胞的死亡方式。于sci后不同时间点采用gfap免疫组化染色,观察脊髓空洞的动态变化;采用gfap/cleavedcaspase-3及gfap/tunel双标染色观察星形胶质细胞是否以凋亡形式死亡;采用gfap/lc3、gfap/beclin1及gfap/lamp2a双标染色观察星形胶质细胞是否以自噬形式死亡;由于gfap染色不能代表星形胶质细胞整个胞浆而可能产生假阴性结果,所以我们进一步采用gfap-creer:rosa-yfp工具小鼠,研究星形胶质细胞是否以凋亡或自噬形式死亡;采用体内pi染色及三维重建,观察星形胶质细胞是否发生坏死。结果显示,星形胶质细胞不发生凋亡,且只有少量星形胶质细胞发生自噬,而空洞周围存在大量pi阳性(约80%)的星形胶质细胞,提示脊髓损伤后星形胶质细胞发生坏死。第二部分:小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞发生necroptosis及保护研究本部分实验通过小鼠脊髓夹伤模型,研究星形胶质细胞的坏死及相关保护研究。于脊髓损伤后不同时间点采用westernblotting检测necroptosis相关标志物rip3的表达情况;采用gfap/rip3、gfap/mlkl及gfap/hmgb1免疫组化染色观察星形胶质细胞是否发生rip3/mlkl介导的necroptosis;同时采用ox42/rip3免疫组化染色观察小胶质细胞是否发生necroptosis;采用cc1/rip3免疫组化染色观察少突胶质细胞是否发生necroptosis;采用neun/rip3免疫组化染色观察神经元是否发生necroptosis;进一步采用免疫电镜观察rip3及mlkl是否表达在坏死星形胶质细胞上。结果发现,约80%的rip3阳性细胞为gfap阳性,且星形胶质细胞可同时表达mlkl及hmgb1;约有15%的小胶质细胞可表达rip3,而少突胶质细胞及神经元几乎不表达rip3;超微结构结果显示rip3及mlkl主要表达在坏死星形胶质细胞上,以上结果提示脊髓损伤后星形胶质细胞及小胶质/巨噬细胞可发生necroptosis。因此,本课题将以星形胶质细胞和小胶质/巨噬细胞为主进行研究。上述实验证实了脊髓损伤后星形胶质细胞可发生necroptosis,我们进一步研究星形胶质细胞能否在体外发生坏死,通过筛选,我们建立了星形胶质细胞体外坏死模型(tnfα+lps+z-vad联合刺激),通过westernblotting检测necroptosis相关标志物的表达、检测细胞内氧化应激水平ros、活细胞pi染色、细胞atp水平检测证实了星形胶质细胞可发生坏死。进一步采用坏死抑制剂nec-1(其可抑制rip1的磷酸化),及rip3基因敲除小鼠证明了星形胶质细胞可发生necroptosis。基于以上体外星形胶质细胞坏死及保护实验,在体内小鼠脊髓损伤后,采用坏死抑制剂nec-1及rip3基因敲除干预,发现其均可抑制星形胶质细胞坏死,减小脊髓空洞面积;且两种干预措施均可促进损伤旁区神经元存活并改善运动功能恢复,进而我们探讨了其可能的原因,我们分别采用正常星形胶质细胞条件性培养基、坏死星形胶质细胞条件性培养基、抑制坏死的星形胶质细胞条件性培养基刺激体外培养的神经元,采用tunel染色发现坏死星形胶质细胞可促进神经元凋亡,而坏死抑制的星形胶质细胞可部分挽救其效应;正常情况下星形胶质细胞可通过分泌神经营养因子发挥其对神经元的保护作用,我们发现sci后抑制星形胶质细胞坏死可使其gdnf表达增加,于是我们推测星形胶质对神经元的作用可能与其产生gdnf不同的表型相关。第三部分:小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞发生necroptosis的机制本部分实验通过小鼠脊髓夹伤模型,研究sci后星形胶质细胞发生necroptosis的机制。文献报道炎症反应对空洞形成至关重要,且m1型小胶质/巨噬细胞具有细胞毒性,我们推测星形胶质细胞坏死可能与m1型小胶质/巨噬细胞相关。于sci后不同时间点,采用westernblotting检测necroptosis相关标志物mlkl、hmgb1及m1型小胶质/巨噬细胞标志物inos的表达情况;结果发现inos和mlkl、hmgb1的表达呈相关关系。在体外我们分别以m0、m1及m2型小胶质/巨噬细胞条件性培养基刺激星形胶质细胞,采用westernblotting检测坏死标志物、活细胞pi染色及细胞内atp检测,发现m1型小胶质/巨噬细胞可诱导星形胶质细胞发生necroptosis。基于以上体外实验,在体内小鼠脊髓损伤后,采用m1型小胶质/巨噬细胞特异性去除剂gdcl3于损伤局部定位注射以去除m1型小胶质/巨噬细胞,发现其可减轻小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞坏死,减小脊髓空洞面积,并改善运动功能恢复;相反,移植m1型巨噬细胞,可增加小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞坏死,增大脊髓空洞面积,且不利于运动功能恢复。第四部分:tlr4/myd88信号通路参与星形胶质细胞necroptosis然而m1型小胶质/巨噬细胞诱导星形胶质细胞necroptosis的机制尚不清楚,除了经典的tnfα通路与细胞坏死相关外,有报道显示tlr通路参与其他系统巨噬细胞的necroptosis,且参与脊髓损伤后星形胶质细胞活化,此外,在我们体外星形胶质细胞的坏死模型中,除tnfα和z-vad外,lps对诱导星形胶质细胞necroptosis起重要作用,我们推测tlr通路参与星形胶质细胞necroptosis。在tlr受体家族中,tlr2和tlr4可对相同的刺激产生反应,且都参与星形胶质细胞的活化。小鼠sci后,采用gfap/tlr2、gfap/tlr4、gfap/myd88及tlr4/rip3免疫组化染色观察坏死星形胶质细胞是否表达tlr通路相关蛋白,结果发现损伤区周围坏死星形胶质细胞几乎不表达tlr2,而高表达tlr4及myd88,同时rip3阳性细胞也可表达tlr4,提示tlr4/myd88可表达于坏死星形胶质细胞上;在体外tlz及m1诱导的星形胶质细胞坏死模型中,以myd88抑制剂进行干预,采用westernblotting检测坏死标记物及活细胞pi染色,结果都发现tlr4/myd88可部分介导星形胶质细胞发生necroptosis。基于以上体外实验结果,在小鼠sci后,以特异性去除剂gdcl3去除m1型小胶质/巨噬细胞后,我们发现其可抑制星形胶质细胞表达tlr4/myd88;相反,移植m1型巨噬细胞可促进星形胶质细胞表达tlr4/myd88。以上实验表明tlr4/myd88通路可能参与小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞的necroptosis。第五部分:人脊髓损伤后星形胶质细胞发生necroptosis的机制以上结果是小鼠脊髓损伤后星形胶质细胞发生necroptosis的机制及保护研究,然而,在人脊髓损伤后是否存在相同或相似的病理机制尚不清楚,我们获得了正常及脊髓损伤后的组织标本,采用gfap/rip3、gfap/mlkl、gfap/pmlkl、gfap/hmgb1、gfap/tlr4、gfap/myd88及tlr4/rip3免疫组化染色,结果发现正常人脊髓组织不表达mlkl、pmlkl、hmgb1及tlr4,且几乎不表达rip3及myd88,但在人脊髓损伤后5天星形胶质细胞可高表达rip3、mlkl、pmlkl及hmgb1,表明人脊髓损伤后,星形胶质细胞也可发生necroptosis;星形胶质细胞同时表达tlr4及myd88,且有一定数量的tlr4/rip3双阳性细胞;相同的表达模式还见于另一个脊髓损伤后15天的病人病理标本中,提示tlr4/myd88参与的星形胶质细胞necroptosis可能是脊髓损伤后的一个保守性的病理变化。第六部分:脊髓损伤后小胶质/巨噬细胞necroptosis的研究。以上是星形胶质细胞necroptosis的研究。如第二部分所述,有少量小胶质/巨噬细胞也显示出rip3阳性,提示其也可发生necroptosis。本部分实验通过建立小鼠脊髓夹伤模型,研究脊髓损伤后空洞扩大过程中小胶质/巨噬细胞的necroptosis。于sci后采用iba-1/mlkl、gfap/mlkl、cc1/mlkl、neun/mlkl免疫组化染色,观察坏死分子mlkl的细胞表达类型及比例;采用iba-1/mlkl/pi三标染色确认小胶质/巨噬细胞的necroptosis,并观察nec-1干预后小胶质/巨噬细胞的坏死情况;采用iba-1/mlkl/cxcr4组化染色及免疫电镜,观察mlkl的细胞定位;结果发现,约57%的mlkl阳性细胞为iba-1阳性,且免疫组化三标染色及电镜结果都显示mlkl可表达于小胶质/巨噬细胞的胞膜和胞浆;电镜同时显示,MLKL阳性的胶体金颗粒的胞浆定位主要为内质网,提示内质网可能参与小胶质/巨噬细胞的necroptosis。进一步采用内质网应激相关蛋白GRP78组化染色,结果显示坏死小胶质/巨噬细胞可有GRP78的表达;进而在体外氧糖剥夺(OGD)模型、Nec-1及内质网应激抑制剂4-PBA干预条件下,观察小胶质细胞内质网应激及坏死情况,结果显示OGD可诱导小胶质细胞内质网应激及necroptosis,而Nec-1及4-PBA可抑制其发生necroptosis。以上结果提示,除星形胶质细胞坏死外,SCI后小胶质/巨噬细胞可发生内质网应激参与的necroptosis。