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肠动力不足（Intestinal motility deficiency,IMD）是重型颅脑损伤（Severe head injury,SHI）后常见的并发症。如果不能在早期进行有效的防治,可引起肠道菌群紊乱、加重机体炎症反应,甚至诱发多器官功能障碍综合征。目前临床用于防治IMD的药物均存在一定的副作用。近年来,益生菌在危重症患者治疗中的作用受到关注。研究表明,益生菌不仅能纠正严重创伤患者的肠道菌群失调,还具有改善肠动力的作用。但迄今大多数研究仅观察了用益生菌后的效果,对其改善肠动力相关机制的研究较少。平滑肌细胞的收缩舒张是肠动力的最终效应器,而钙依赖性通路是调控平滑肌细胞收缩的重要通路。当细胞受到外界刺激时胞外Ca2+可经细胞膜上的Cav1.2钙离子通道流入细胞内,同时胞内钙库也会通过肌质网膜上的IP3R、RyR3释放部分Ca2+,使胞内游离的Ca2+浓度升高,Ca2+与Ca M、MLCK形成Ca2+/Ca M/MLCK复合物,最终使MLC20磷酸化,引起平滑肌收缩。由此可见,MLC20的磷酸化水平与平滑肌细胞的收缩有密切的关系。此外,研究还发现PKC在调节MLC20磷酸化水平及肠道平滑肌收缩中也至关重要。课题组前期研究发现嗜酸乳杆菌可改善SHI小鼠肠道平滑肌的收缩功能,本研究在此基础上采用SHI小鼠肠动力不足模型,以调节肠道平滑肌收缩的钙依赖性通路为切入点,分别在给SHI小鼠灌胃嗜酸乳杆菌1d、3d、7d后观察其肠道平滑肌钙依赖性通路中信号分子的变化,初步揭示嗜酸乳杆菌改善SHI小鼠肠动力不足的可能机制。本课题旨在为嗜酸乳杆菌用于创伤领域提供实验证据,同时对探讨益生菌改善肠动力的相关机制提供参考依据。研究目的观察SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路信号分子的表达变化,明确嗜酸乳杆菌对伤后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路的影响,初步揭示嗜酸乳杆菌改善SHI小鼠肠动力不足的分子机制。实验方法本研究将90只健康雄性C57BL/6小鼠（18-24g）随机分为假伤组、损伤组和损伤+嗜酸乳杆菌组（每组30只）。每组小鼠均分为1d、3d、7d三个时相点（每一时相点10只小鼠）。各组小鼠均用5%的水合氯醛进行腹腔麻醉。损伤组和损伤+嗜酸乳杆菌组均采用改良的Feeney’s自由落体撞击法建立SHI后肠动力不足小鼠模型。假伤组只开骨窗,不进行打击。伤后约4h待小鼠清醒后开始灌胃。假伤组及损伤组小鼠灌胃0.5ml嗜酸乳杆菌培养基溶液,损伤+嗜酸乳杆菌组灌胃相同体积的嗜酸乳杆菌混悬液（约含菌1×1010CFU）。每天灌胃一次,其余时间均自由饮食水。分别在伤后1d、3d、7d留取末端回肠（距盲肠1.5cm）。蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测20KDa肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化水平。酶联免疫吸附实验（ELISA）及免疫组织化学染色技术检测肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的表达量,ELISA检测MLCK的活性。ELISA检测PKC蛋白水平、L型钙离子通道Cav1.2、三磷酸肌醇受体（IP3R）、雷诺定受体（RyR3）的表达量。主要结果1.MLC20磷酸化水平变化Western blotting结果:与假伤组相比较,MLC20在SHI后1d、3d、7d的磷酸化水平均明显降低（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P<0.05）;嗜酸乳杆菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠肠道平滑肌MLC20的磷酸化水平显著升高（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P<0.05）。2.MLCK表达量及活性变化ELISA及免疫组化结果:MLCK在SHI后1d、3d、7d的蛋白浓度均明显低于假伤组（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P<0.05）;嗜酸乳杆菌干预1d、3d、7d后MLCK的浓度均显著高于损伤组（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P<0.01）。同时,伤后1d、3d、7d的MLCK活性均低于相同时相点假伤组MLCK的活性（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P<0.01）;嗜酸乳杆菌干预1d、3d和7d后MLCK的活性显著增强,且与损伤组相比差异有统计学意义（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P<0.05）。3.PKC蛋白水平变化ELISA结果:SHI后1d、3d、7d的PKC水平明显高于假伤组相同时间点PKC的水平（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d:P<0.05）;嗜酸乳杆菌灌胃1d、3d、7d后SHI小鼠肠道平滑肌PKC水平显著降低（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P<0.05）。4.Cav1.2表达量变化ELISA结果:SHI后第1d及损伤3d和7d后,小鼠肠道平滑肌Cav1.2的表达量均明显降低（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P<0.01）;嗜酸乳杆菌干预1d、3d和7d后Cav1.2的表达量均显著高于损伤组（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P<0.01）。5.IP3R表达量变化ELISA结果:IP3R在SHI后第1d及伤后3d和7d的表达量均明显低于相同时相点假伤组IP3R的表达量（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P<0.01）;IP3R在嗜酸乳杆菌灌胃1d后的表达量虽有升高,但与损伤组相比差异无统计学意义（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d:P>0.05）,嗜酸乳杆菌灌胃3d和7d后SHI小鼠肠道平滑肌IP3R表达量显著提高（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,3d,7d:P<0.01）。6.RyR3表达量变化ELISA结果:SHI后1d、3d、7d的RyR3表达水平均显著降低（损伤组vs假伤组,1d,3d,7d,P<0.01）;嗜酸乳杆菌灌胃第1d及灌胃3d和7d后RyR3蛋白水平均有升高,但与损伤组相比差异均没有统计学意义（损伤+嗜酸乳杆菌组vs损伤组,1d,3d,7d:P>0.05）。结论1.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路信号分子的表达水平发生异常变化。2.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路中MLC20的磷酸化水平降低,MLCK的活性减弱、表达量下降。嗜酸乳杆菌可增强伤后MLCK的活性、提高MLCK的表达量及MLC20的磷酸化水平。3.SHI后小鼠肠道平滑肌钙依赖性通路中PKC的水平明显升高,嗜酸乳杆菌可降低伤后PKC的蛋白水平。4.SHI后小鼠肠道平滑肌钙离子通道Cav1.2、IP3R、RyR3表达量降低,嗜酸乳杆菌可提高伤后Cav1.2、IP3R、RyR3的表达水平。