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目的:急性早幼粒白血病细胞L型PML-RARα融合基因,由于PML基因第5、6外显子存在选择性剪接,形成E5(-)E6(+)(第5外显子缺失),E5(-)E6(-)(第5、6外显子均缺失),E5(+)E6(+)(第5、6外显子均存在)三种不同的剪接转录本。前期研究已证实:高表达E5(-)E6(-)剪接体的急性早幼粒白血病患者预后差,可能由于其失去核定位信号导致胞浆定位而表现出对ATRA诱导分化作用敏感性差。本研究旨在稳定表达剪接体的克隆细胞与NB4细胞水平探讨E5(-)E6(-)剪接体对三氧化二砷(ATO,As2O3)作用的敏感性,从而为急性早幼粒细胞白血病患者提供临床治疗指导。方法:1、将NB4细胞经0.1μM、0.2μM、1.0μM、1.5μM和2.0μMATO分别作用0-96h,通过流式细胞术检测药物作用后各时间点NB4细胞CD33和CD11b的表达、Annexin-V和PI(Propidium Iodide)的阳性率,分析其分化和凋亡情况,确定ATO作用浓度。2、采用荧光定量PCR法检测分化和凋亡最佳浓度的ATO作用于NB4细胞后,各时间点E6(+)和E5(-)E6(-)剪接体表达量变化。3、将前期构建成功的pCDH1空载体、pCDH1-E5(-)E6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)分别与包装辅助质粒pVSV-G、pPACKH1-REV和pPACKH1-GAG共转染293T细胞,收集病毒颗粒,感染HL-60细胞,用有限稀释法筛选不同剪接体稳定克隆细胞株。4、将稳定克隆细胞分别经0.2μM、1.5μMATO作用0-96h,通过流式细胞术检测药物作用后各时间点稳定克隆细胞CD33和CD11b的表达、Annexin-V和PI的阳性率;同时,采用荧光定量PCR法分别检测分化和凋亡过程中,各时间点稳定克隆细胞剪接体表达量变化;采用免疫荧光法联合共聚焦荧光显微镜观察各时间点稳定克隆细胞PML核体的变化。结果:1、不同ato药物浓度作用于nb4细胞后,随着作用时间的延长,0.2μmato组nb4细胞cd11b的表达较其余组别呈明显上升趋势,而1.5μmato组nb4细胞的annexin-v和pi表达上升趋势明显,故确定ato分化与凋亡最佳浓度分别为0.2μm和1.5μm。2、荧光定量pcr检测结果表明:1.5μmato作用于nb4细胞后,随着时间的延长e6(+)和e5(-)e6(-)剪接体的表达量均呈逐渐下降趋势,且在72h和96h与对照组相比有显著的差异(p<0.05);0.2μmato作用于nb4细胞,随着药物作用时间的延长e6(+)、e5(-)e6(-)剪接体表达量下降趋势不明显,且各时间点与对照组相比无显著性差异(p>0.05);同一浓度、同一时间点e6(+)、e5(-)e6(-)剪接体表达量下降程度均无显著性差异(p>0.05)。3、稳定表达剪接体的克隆细胞筛选:通过慢病毒感染hl-60细胞,有限稀释法筛选稳定克隆细胞株,最终得到hl-60-pcdh1空载体、hl-60-pcdh1-e5(-)e6(+)、hl-60-pcdh1-e5(-)e6(-)三种分别表达各剪接体的稳定克隆细胞,并经rt-pcr验证,目的基因均有正确表达。4、0.2μm、1.5μmato作用于稳定表达剪接体的克隆细胞后,随着作用时间的延长,0.2μmato组pcdh1空载体、pcdh1-e5(-)e6(+)、pcdh1-e5(-)e6(-)稳定克隆细胞cd11b的阳性率随着药物作用时间的延长呈上升趋势,pcdh1空载体组上升趋势更明显;1.5μmato组三种剪接体稳定克隆细胞annexin-v和pi的阳性率随着药物作用时间的延长而递增,pcdh1空载体组上升趋势更明显。荧光定量pcr检测结果表明:1.5μmato组随着药物作用时间的延长pcdh1-e5(-)e6(+)、pcdh1-e5(-)e6(-)稳定克隆细胞其e6(+)、e5(-)e6(-)剪接体的表达量分别呈逐渐下降趋势;0.2μmato组随着药物作用时间的延长e6(+)、e5(-)e6(-)剪接体表达量下降趋势不明显。同一浓度、同一时间点e6(+)、e5(-)e6(-)剪接体表达量下降程度均无显著性差异。5、免疫荧光联合共聚焦结果表明:1.5μmato组随着药物作用时间的延长pcdh1-e5(-)e6(+)、pcdh1-e5(-)e6(-)稳定克隆细胞pml核体结构恢复成正常的数十个斑点状结构;0.2μmato组随着药物作用时间的延长pcdh1-e5(-)e6(+)、pCDH1-E5(-)E6(-)稳定克隆细胞PML核体结构变化不明显。结论:从内源性和外源性两方面均证实E5(-)E6(-)剪接体对ATO作用敏感;E5(-)E6(-)剪接体对PML核体具有显性负作用,且ATO的作用可使PML核体结构恢复至正常。