环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类由pre-mRNA通过反向剪切形成的单链闭合共价非编码RNA。近年来发现环状RNA广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程,也参与了心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病、各类肿瘤等疾病的发生发展。它们发挥生物学作用主要有两种途径,一种是作为miRNA的分子海绵,吸附miRNA,调控miRNA的表达水平,从而解除miRNA对靶基因的抑制作用。另外一种途径是能够结合蛋白质,或直接影响结合蛋白的表达水平,或影响蛋白相关的下游信号通路。神经系统的发育是一个复杂而有序的过程,需要对神经元的生长和发育进行精确调控,大量非编码RNA参与了这个过程的调控。许多环状RNA在脑内高表达,并且表现出组织特异性和时空特异性。前人通过对小鼠和人脑组织的环状RNA测序,发现CircCpsf6的存在,并且进一步验证发现,CircCpsf6在脑内高度富集、保守。随着神经元分化时间的延长,CircCpsf6的含量逐渐增多。据此,我们猜测CircCpsf6可能会在神经元的分化发育过程中发挥重要的调控作用。然而,其具体的机制仍然是不清楚的,因此,本研究的主要目标是探讨CircCpsf6在神经发育过程中的作用及分子调控机制。本研究首先选择了小鼠神经样细胞系N2a作为神经元分化的细胞模型。研究发现,随着N2a细胞分化时间延长,CircCpsf6的含量增多,提示CircCpsf6确实可能参与了神经元的分化发育。神经突的形成是神经元发育最早期、基础、关键的步骤,于是我们通过免疫荧光染色的方法,在小鼠N2a细胞、人SH-SY5Y细胞和小鼠原代培养的皮层神经元中进行了神经突数量和长度的检测。通过敲减和过表达CircCpsf6,证明了CircCpsf6可以促进神经突的生长。为了继续探究CircCpsf6调控神经元发育的分子机制,我们进行了 N2a细胞中CircCpsf6敲减模型的miRNA测序和mRNA测序。通过荧光定量PCR实验,双荧光素酶实验,发现miR-214-5p是CircCpsf6间接调控的下游miRNA。MiR-214-5p在N2a细胞中随分化时间延长,含量降低。MiR-214-5p在N2a细胞中能够抑制神经突的生长,通过CircCpsf6与miR-214-5p的补救实验,miR-214-5p的沉默能够补救CircCpsf6敲减导致的神经突生长抑制,这些结果表明,CircCpsf6可以通过调控miR-214-5p的表达水平从而促进神经元的发育。四个数据库结合mRNA测序数据交集到了 miR-214-5p的靶基因,通过双荧光素酶实验验证了 Unc5a是miR-214-5p的靶基因。过表达miR-214-5p后,Unc5a的表达水平下降,敲减miR-214-5p后,Unc5a的表达水平上升。Unc5a的表达水平也受到CircCpsf6的调控。Unc5a随N2a分化时间延长,含量升高。Unc5a在N2a细胞中能够促进神经突的生长,通过CircCpsf6与Unc5a的功能恢复实验,Unc5a的沉默逆转了 CircCpsf6过表达导致的神经突生长促进。这些结果表明,CircCpsf6可以通过调控miR-214-5p/Unc5a轴从而促进神经元的发育。采用CCK8的方法在N2a细胞、SH-SY5Y细胞中进行了细胞活力实验。发现CircCpsf6可以抑制N2a细胞、SH-SY5Y细胞的细胞活力。接着在CircCpsf6的成环接口处设计了特异性的生物素探针,进行CircCpsf6的下拉实验,即RNA反义纯化实验,拉下CircCpsf6的同时,会将CircCpsf6结合的蛋白一同拉下,然后对蛋白进行洗脱、纯化、质谱检测,得到了 CircCpsf6可能结合的385个蛋白。对这385个蛋白进行了蛋白与蛋白之间可能的相互作用预测,以期找到功能强大的蛋白。同时进行了 GO分析和KEGG分析,结果表明,CircCpsf6可能通过结合蛋白影响细胞的增殖或者凋亡从而抑制神经细胞的细胞活力。结合CircCpsf6在神经元中的分化实验,我们推测CircCpsf6可能对神经细胞起到抑制增殖,促进分化的作用。综上所述,我们的研究结果表明CircCpsf6可以通过调控miR-214-5p/Unc5a轴促进神经元的发育,CircCpsf6可能通过结合蛋白影响细胞活力,进而调控神经元的生长发育。通过CircCpsf6调控神经元生长及发育过程的分子机制研究,对于我们理解环状RNA在神经发育过程中的调控作用具有重要意义,也能为相关神经系统疾病的诊断和治疗提供一定的思路与参考。