前言 新生儿窒息是围生期常见的对新生儿危害极大的疾病，是新生儿死亡和伤残的主要病因之一，本病致死致残的主要原因是窒息缺氧造成多脏器(心、脑、肾、胃肠道等)损伤。国内报道窒息后胃肠损害的发生率为33％，多于中枢神经系统的损伤。临床上也注意到出生窒息后新生儿易合并胃肠道损害，甚至发生病死率极高的坏死性小肠结肠炎。虽然胃肠道并非所谓的生命器官，但由于它承担着大部分消化吸收功能，对提供机体必要的能量和营养素需求，维持机体正常的新陈代谢和生长发育起着至关重要的作用。但对窒息后消化道粘膜屏障的成熟与完善，是否受损，损伤后的增殖修复能力如何，研究报道较少。 肠三叶因子(ITF)属三叶肽家族，是近年来被人们注意到的对胃肠道粘膜屏障有重要保护和修复作用的多肽，是一种新型的生长因子类多肽物质。它的生理功能主要体现在两个方面：首先ITF可与粘液糖蛋白相互作用或交联，形成粘弹性的粘液凝胶层，对肠道粘液层起固定和支持作用，防止有害物质对肠粘膜细胞的损伤，从而增强胃肠道粘膜屏障的保护能力；其次ITF具有很强的促进细胞增殖与移行的能力，被认为是粘膜损伤的快速反应肽，在损伤早期即可表达，促进受损区域上皮细胞重建并加快上皮细胞移行速度，因而在肠道的自我保护机制中占据重要地位。 增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen PCNA)又称周期蛋白。它是一种核内蛋白质，是DNA聚合酶的一个辅助蛋白，其合成和表达与细胞增殖有关，可能调节DNA复制。在正常增殖的组织和部分肿瘤组织中PCNA是人们所期望的理想的增殖细胞标志，目前许多研究项目已将PCNA列为一项常规检测增生细胞的方法。 本实验以宫内窒息鼠为模型，采用RT－PCR及免疫组化方法在分子和蛋白水平探讨窒息后不同时间肠道中ITF的变化规律及其与肠道损伤和修复的关系，以期了解窒息后新生儿消化道症状产生的病理生理基础，并阐明ITF保护肠粘膜的作用机制，为胃肠疾病的预防治疗提供一个新的思路。 材料与方法 一、动物模型制备 妊娠足月p 天）孕鼠麻醉后下腹正中开腹，暴露双角子宫及供应一侧子宫和卵巢的动静脉血管，钳夹20分钟。以对测宫角内未钳夹的胎鼠为对照组（假手术组八达到预定缺血时间后娩出胎鼠，进行窒息复苏，建立正常呼吸，代乳鼠代乳。分别饲养0、24户8＊2小时后处死，留取样本。每个时间点留取5个标本。 二、方法 1．用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法半定量检测ITFmR－NA的表达，以ITF的相对表达量即ITF／p－achn进行计算。用免疫组化技术检测肠道PCNA蛋白表达，应用Meta M。ph软件测定平均灰度。进行常规HE染色，镜下判定粘膜损害指数OMDI人 2．试剂jTF引物：由 Gene Bank查出全序列，由 PiIYun 5．0软件设计处理，连同p－actin引物均由北京奥科生物工程公司合成；TRIZOL总 RNA提取试剂购自美国 promega公司；反转录和PCR扩增所需的酶和其它试剂均购自日本TaKaRa公司；PCNA免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。 统计学处理：所有数据用均值。标准差（X。s）表示，差异比较采用SpS 10．0统计软件的t检验与 hD检验＊检验人并进 ·2· 行Speannan相关分析。 结 果 1．ITFm RN A正常在ZI日胎龄仔鼠已有一定表达，并随日龄 的增加而逐渐增加，宫内缺血缺氧后当时ITFmRNA的表达即有 降低（0．86。0．043），到生后24小时降到最低点（0．59。0．032）， 48小时表达量有所增加（0．83。0．021），到生后72小时迅速增加 甚至超过对照组O．19。0．021人与相应对照组相比差异显著u ＜o．01人窒息后各时间点ITF’W A表达量比较亦差异显著K＜ 0．of）。 2．正常ZI日胎龄仔鼠肠组织中即有PCNA蛋白的表达，表达 部位主要在肠粘膜杯状细胞的胞核中，且阳性细胞集中于肠粘膜 隐窝处，绒毛顶端仅有少量表达。宫内缺血缺氧20分钟后，早期 PCNA表达即开始下降（56．75。l．18），24 ／J’时继续下降（55．22 SZ．14），到48小时降到最低谷（53．29。二．97），72小时表达增加 并接近正常对照组抽1．SO土2．72入各时间点相比差异显著瞩＜ 0．of）。 3．镜下可见正常ZI日龄胎鼠肠组织各层发育基本成熟，有绒 毛形成但较短，分支少，肠壁较薄，肠腺数量少，随日龄的增加肠壁 各层逐步发育成熟。宫内缺血缺氧复苏后0小时，即发现部分肠 绒毛中轴固有层充血OMDI为0．67＊0．16X复苏后24小时肠道 损伤进一步加重OMDI为2．47。0．17入到48小时达到最重，绒 毛数量明显减少，部分绒毛脱落，上皮细胞肿胀，变性、坏死、脱落， 固有层裸露，中轴固有层明显充血、水肿，中央乳糜管扩张，IMDI 也大幅度上升达门．40＊0．16人至日龄达到72小时，虽绒毛数 量较对照组仍略少，但上皮及间质的改变已经恢复，仅有局部毛细 血管略充血OMDI为＊60 L 0．ZI?