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1.基于生物信息学分析挖掘在肝细胞癌中起抑癌作用的miR-1247-5p目的:旨在找到在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）中起抑癌作用的miRNA,探讨其在体外对人肝癌细胞系增殖、侵袭和迁移是否具有抑制作用并找到其靶向调控基因。方法:（1）利用生物信息学方法挖掘在HCC中可能起抑癌作用miRNA和其可能靶向调控基因。（2）使用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）和Western Blot分别检测肝癌组织芯片和临床肝癌组织中KIF18B的表达水平。（3）将miR-1247-5p的mimics和inhibitor分别转染Hep G2和Huh7人肝癌细胞系,通过实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）检测转染后肝癌细胞系miR-1247-5p的表达水平。（4）将KIF18B的过表达质粒和小干扰RNA（Small Interfering RNA,si RNA）分别转染Hep G2和Huh7人肝癌细胞系,通过Western Blot和q RT-PCR检测转染后肝癌细胞系KIF18B的表达水平。（5）克隆形成实验和CCK8毒性实验验证miR-1247-5p和KIF18B过表达和敲低后分别对Hep G2和Huh7人肝癌细胞系增殖的影响。（6）划痕实验和Transwell小室实验验证miR-1247-5p和KIF18B过表达和敲低后分别对Hep G2和Huh7人肝癌细胞系侵袭和迁移的影响。（7）构建KIF18B 3’UTR的野生型和突变型荧光素酶报告载体,通过q RT-PCR、Western Blot以及双荧光素酶实验明确miR-1247-5p对KIF18B的调控作用。（8）功能挽救实验验证KIF18B能否逆转miR-1247-5p对HCC细胞系的生物学行为。结果:（1）miR-1247-5p在TCGA数据库的HCC组织中低表达,预示着患者较长的生存期,并且与进展期的临床病理特性呈负相关性。（2）KIF18B在HCC患者中显著高表达,预示着患者的不良预后,并且与晚期临床分期和较差的分化程度呈正相关性。（3）与对照组相比,分别转染miR-1247-5p mimics和inhibitor后,肝癌细胞系miR-1247-5p的表达水平均有不同程度的明显升高和降低。（4）与对照组相比,分别转染KIF18B的过表达质粒和si RNA后,肝癌细胞系KIF18B的m RNA和蛋白表达水平均有不同程度的明显升高和降低。（5）过表达miR-1247-5p和敲低KIF18B对Hep G2和Huh7人肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭均具有明显的抑制作用,反之将Hep G2和Huh7人肝癌细胞中的miR-1247-5p抑制或KIF18B过表达后,肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力均明显增强。（6）KIF18B是miR-1247-5p在HCC中的直接靶基因,miR-1247-5p能调控KIF18B m RNA和蛋白的表达水平。（7）KIF18B能部分逆转miR-1247-5p对人肝癌细胞系的生物功能学影响。结论:miR-1247-5p通过抑制下游调控基因KIF18B的表达来抑制人肝癌细胞系的增殖、侵袭和转移。2.环状RNA circ-0070934通过miR-1247-5p/KIF18B信号轴促进肝细胞癌的增殖和转移目的:旨在找到在肝细胞癌中调控miR-1247-5p的circRNA,探讨其是否可以作为miR-1247-5p的海绵体,减少miR-1247-5p与KIF18B 3’UTR的结合从而促进肝癌细胞系的增殖、侵袭和迁移。方法:（1）通过生物信息学方法、Ago2-RIP qPCR实验以及双荧光素酶实验筛选可能目标的circRNA。（2）使用Sanger测序、RNase R消化实验和放线菌素D实验对Hep G2和Huh7人肝癌细胞系中的circ-0070934进行鉴定。（3）设计circ-0070934和U6的荧光原位杂交（Fluorescence in Situ Hybridization,FISH）探针,通过RNA核质分离实验和FISH实验对circ-0070934进行细胞定位分析。（4）构建circ-0070934的野生型和突变型荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶实验、q RT-PCR和FISH共定位进一步证实circ-0070934是否可以直接靶向miR-1247-5p。（5）将circ-0070934的过表达质粒和si RNA分别转染Hep G2和Huh7人肝癌细胞系,通过q RT-PCR定量检测转染后肝癌细胞系circ-0070934的表达水平。（6）通过克隆形成实验、CCK8毒性实验、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷细胞增殖分析、流式细胞凋亡和周期检测去验证circ-0070934过表达和敲低后分别对Hep G2和Huh7人肝癌细胞系增殖的影响,通过Western Blot检测PCNA、cyclin D1、p21、Bcl-2、c-caspase3的蛋白表达。（7）Transwell小室实验验证circ-0070934过表达和敲低后分别对Hep G2和Huh7人肝癌细胞系侵袭和迁移的影响,通过Western Blot检测上皮细胞间质转化（Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT）相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及基质金属蛋白酶家族（Matrix Metalloproteinases,MMPs）相关蛋白MMP2、MMP3和MMP9的表达。（8）功能挽救实验验证miR-1247-5p和KIF18B能否逆转circ-0070934对HCC细胞系的生物学行为。结果:（1）miR-1247-5p指导Ago2蛋白识别并富集circ-0082730、circ-0074817、circ-0070934、circ-0054715和circ-0062517。miR-1247-5p能够降低野生型circ-0082730和circ-0070934的荧光素酶活性。（2）源自LARP1B基因外显子所形成的环状RNA circ-0070934的剪切成熟序列长度为745bp,其能够抵抗RNase R的消化和放线菌素D的降解。（3）Circ-0070934主要分布于HCC细胞的细胞质中,在细胞核内也有少量分布。（4）miR-1247-5p是circ-0070934在HCC中的直接靶标。（5）与对照组相比,分别转染circ-0070934的过表达质粒和si RNA后,肝癌细胞系circ-0070934的表达水平均有不同程度的明显升高和降低。（6）敲低circ-0070934可明显抑制Hep G2和Huh7人肝癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡并促使细胞发生G1-S期阻滞,下调PCNA、cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达。（7）过表达的circ-0070934可明显促进Hep G2和Huh7人肝癌细胞的侵袭和迁移能力,诱导肝癌细胞系发生EMT并上调MMPs相关蛋白的表达。（8）miR-1247-5p和KIF18B能部分逆转circ-0070934对人肝癌细胞的生物功能学影响。结论:Circ-0070934主要定位于细胞质,通过竞争性结合miR-1247-5p,上调KIF18B的表达,抑制细胞的凋亡、调控细胞周期进展并使肝癌细胞系发生上皮间质转化。3.环状RNA circ-0070934通过抑制p53依赖性生长停滞促进肝细胞癌的恶性进展目的:深入探索circ-0070934在体内外对肝癌细胞系生物功能学的分子机制,检测circ-0070934、miR-1247-5p和KIF18B在人肝癌组织中的表达并对circ-0070934的表达进行临床特征差异分析。方法:（1）采用蛋白质谱分析和免疫共沉淀技术寻找并验证与KIF18B相互作用的蛋白。（2）通过Western Blot和邻位连接实验验证circ-0070934对KIF18B和p53结合的调控作用。（3）通过蛋白核质分离实验验证circ-0070934对p53细胞定位的影响。（4）功能挽救实验验证p53能否逆转circ-0070934对HCC细胞系的增殖影响。（5）分别构建circ-0070934过表达和敲低的病毒,转染HCC细胞系并通过嘌呤霉素建立稳筛细胞系。（6）建立裸鼠皮下移植瘤模型、肺转移瘤模型和脾脏切除的经脾肝转移模型,分析过表达或敲低circ-0070934对移植瘤生长及癌细胞体内转移的影响。（7）通过IHC分析circ-0070934的表达水平对移植瘤中KIF18B、EMT和MMPs相关蛋白的影响。（8）生物信息学分析circ-0070934母基因LARP1B的临床意义以及circ-0070934潜在的富集信号通路。（9）q RT-PCR检测56例肝癌组织标本中circ-0070934表达水平,分析circ-0070934的表达差异性与临床病理特征的相关性。结果:（1）KIF18B与p53存在相互作用。（2）Circ-0070934可以促进KIF18B与p53的结合。（3）Circ-0070934促进p53的出核。（4）p53能部分逆转circ-0070934对HCC细胞系的增殖影响。（5）Circ-0070934过表达和敲低的稳筛细胞系可耐受含高浓度嘌呤霉素的完全培养基。（6）在裸鼠皮下移植瘤模型以及经脾肝转移模型中,过表达的circ-0070934对移植瘤的生长和癌细胞体内肝转移较对照组有明显的促进作用,而同时过表达miR-1247-5p能逆转这个现象。在裸鼠皮下移植瘤模型和肺转移瘤模型中,相对于对照组,敲低的circ-0070934对移植瘤的生长和癌细胞体内肺转移有明显的抑制作用。（7）IHC分析表示circ-0070934能够影响移植瘤中KIF18B、EMT和MMPs相关蛋白的表达。（8）Circ-0070934母基因LARP1B的组织表达差异性与HCC的临床分期和患者预后无相关性。Circ-0070934在GSE97332芯片的HCC组织中高表达,可能与细胞转录、自噬和TGF-β信号通路相关。（9）人肝癌组织中的circ-0070934相对于其癌旁正常组织高表达,其组织表达差异性与晚期临床病理特征呈正相关关系。结论:Circ-0070934在人肝癌组织中高表达,通过抑制p53依赖性生长停滞促进肝细胞癌的恶性进展。