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在脊椎动物中,非晶状体βγ-晶状体蛋白广泛的在各种组织中表达,然而对于其功能和详细的分子作用机制知之甚少!关于三叶因子作为胃黏膜修复启动者,关于其在肿瘤发生,创伤修复的详细的分子机制目前还很不清楚。从大蹼铃蟾皮肤分泌中分离纯化到的一类全新的大分子蛋白质复合物,由非晶状体βγ-晶状体蛋白和三叶因子通过非共价键连接而成,分子形式为αβ2,命名为βγ-crystallin and trefoil factor complex),通过生物化学和分子生物学研究手段,分别获得了两个亚基的cDNA全克隆,结合肽指纹图谱,两个亚基N端和内肽序列信息,确定了两个亚基的蛋白质序列。表明βγ-cat的αβ两个亚基分别属于非晶状体βγ-晶状体蛋白家族和三叶因子家族,其中α亚基与人源的黑色素瘤缺失蛋白(AIM1)和日本蝾螈表皮分化蛋白EP37家族具有很高的序列相似性;β亚基与人源的三叶因子2/3(hTFF2/TFF3)具有很高的相似度,β亚基含有三个三叶因子结构域,根据文献检索和序列比对,在高等哺乳动物中,目前还没有含有三个三叶因子结构域的三叶因子的报道。因此,βγ-cat作为一类全新的非晶状体βγ-晶状体蛋白和三叶因子以非共价键连接而成的天然形式存在的蛋白分子,根据现有文献资料,在世界还是首次!
采用anti-βγ-cat-α的兔源多克隆抗体来检测βγ-cat的组织表达分布,在大蹼铃蟾的皮肤,小肠,胃和心检测到阳性信号,而阴性对照无明显荧光信号。说明在大蹼铃蟾的皮肤,小肠,胃和心等部位存在βγ-cat-α或者是其类似物的表达。
βγ-cat对哺乳动物红细胞表现出很高的溶血活性。我们选取人红细胞作为研究模型,对βγ-cat溶血作用机制进行了系统研究。结果表明,βγ-cat能够在人红细胞膜上形成孔道直径为1.6nm的孔道,从而导致细胞内钾离子迅速外流而导致溶血。βγ-cat不与细胞膜上的脂类结合(如胆固醇,卵磷脂等)。通过Westernblot分析,用兔源anti-βγ-cat-α抗体在人红细胞膜上检测到分子量大于240 kDa的大分子寡聚体。
通过对βγ-cat的α亚基的序列分析,表明βγ-cat的α亚基包含有典型的GTP/ATP酶的保守模体Walker A(IILYDEPS,residues6-13)和Walker B(GQSLSGKS,residues96-103),同时在体外实验中检测到较弱的GTPase/ATPase酶活性和ATP/GTP类似物结合活性,提示βγ-cat的α亚基类似的非晶状体βγ-晶状体蛋白家族可能属于一类新的GTPase/ATPase酶。因此,对βγ-cat分子作用机制和功能的研究很有可能为理解三叶因子和非晶状体βγ-晶状体蛋白两个家族的功能和作用机制提供了一个全新的视角。