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研究背景和目的 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离及其视网膜复位手术后的并发症，也是手术失败的主要原因。它是一种创伤的过度修复反应，有炎性因子和细胞因子的参与。炎症反应是PVR进展中重要的始动因素。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells, RPE)是参与PVR的主要增生细胞，静止状态下其基底膜与Bruch膜紧密结合。PVR发生后，RPE受到始动因素的刺激，开始活化，脱离原位，去分化，移行、增生、发生表型转化等，并分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，最终在视网膜前后表面和玻璃体内形成具有收缩能力的增生膜，造成牵拉性视网膜脱离。 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类结合锌离子、钙依赖的内肽酶家族，在多种组织和细胞存在，具有多种生物学功能：降解ECM及基底膜的有效成分，在ECM动态平衡中起着中心作用；调节细胞粘附；作用于细胞外成分或其他蛋白成分而启动潜在的生物学功能；参与胚胎发育、组织模型再塑及新生血管生成、创伤修复等正常生理过程。基质金属蛋白酶组织型抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)是体内MMPs的组织型抑制剂，主要表现为阻止MMPs酶原活化及抑制已活化的MMPs活性，此外，还具有生长因 第四军医大学博士学位论文子样特性、调控细胞增殖与细胞凋亡等功能。当MMPs/TIMPs的平衡失调就会导致肿瘤浸润、转移、风湿性关节炎等疾病发生。 研究发现PVR增生膜有部分MMPs和TIMPs的表达升高，炎性因子可以刺激培养的hRPE MMPs/TIMPs比例升高。本实验的目的在于:①观察MMP一2、MMP一9、TIMP一1和TIMP一2在PVR增生膜的表达;②对部分增生膜进行组织培养，观察MMP一2、MMP一9、TIMP一1和TIMP一2在伸出细胞的表达;③体外培养的hRPE在用白细胞介素一lp(interleukin一lp，IL一lp)和肿瘤坏死因子(扣mor~515伽加r.a，TNF一a)作用后，检测MMP一2，MMP一9的活性和MMP一2、MMP一9、TIMP一l和TIMP一2的mRNA水平，并分别联合白细胞介素一1受体拮抗剂(interleukin一1reeeptor antagonist，IL一lrA)、金雀异黄素(genistein)、IL一lrA、genistein、地塞米松作用后，观察上述指标的变化;④观察刮伤模型的hRPE细胞内钙离子的变化情况和MMP一2、MMP一9、TIMP一l和TIMP一2的表达。方法①用免疫组织化学的方法，观察PVRC级和D级增生膜中MMP一2、MMP一9、TIMP一l和TIMP一2的表达及原位杂交染色(xSH)观察MMP一2 mRNA的表达，并用透射电镜观察增生膜的超微结构;②临床取材的增生膜进行体外组织培养，观察伸出细胞的情况，并对伸出细胞进行来源鉴定和MMP一2、MMP一9、TIMP一1和TIMP一2免疫组织化学染色;③体外培养hRPE，用酶谱分析法观察IL一lp和TNF一Q作用后细胞MMP一2和MMP一9的活性变化;用ELISA法检测培养上清的MMP一2蛋白分泌，用RT-PCR法检测MMP一2、MMP一9、TIMP一l和TIMP一2的mRNA水平的变化，以及分别联合IL一lrA、genistein、地塞米松作用后上述指标的变化情况;④hRPE的刮伤模型，IL一lp和翎F一a以及分别联合IL一lrA、genistein、地塞米松和抗MMP一2中和抗体作用后RPE的移行情况和细胞内钙离子的变化，以及移行细胞内MMP一2，MMP一9，TIMP一1，TIMP一2的表达和MMP一2的ISH。结果①31例增生膜中22(710，0)9I]表达MMP一2，7(23%)9lJ表达MMP一9阳性，14(45%)例表达TIMP一阳性，9(29%)例表达TIMP一2阳性，统计 第四军医大学博士学位论文学分析与PVR分级之间没有明显相关性(P>O.OS)。但与病程分期(以病程4个月为界分为早期膜和晚期膜)有关:MMP一2和MMP一9主要在早期膜表达，TIMP一1和TIMP一2主要在晚期膜表达。对14例增生膜MMP一ZmRNA ISH染色，结果有9例(64%)阳性，都在早期增生膜表达。②培养21例ERM中，有12(57%)例细胞伸出，其中5例细胞伸出后开始分裂增生，均为上皮源性。早期增生膜更易伸出细胞，并分裂增生。MMp一2和TIMP一，2均表达阳性。③明胶酶谱结果显示:IL一lp和翎F一a作用hRPE后，活性MMP一2的表达升高，并有一定的持续性，72h较对照组分别可增加至239%(IL一1内，209%(TNF一a);IL一lp和r1NF一a作用hRPE后，活性MMP一9的表达升高，24h达到峰值，较对照组分别可增加至179%(IL一lp)，172%(丁NF一a)。IL一lp和TNF一a分别联用IL一lrA、10林Mgenistein、100“Mgenistein、lomg·L‘l地塞米松、100mgL一‘地塞米松后，活性MMP一2表达量下降，分别为未刺激组的112%和174%、190%和210%、87%和75%、134%和154%、43%和60%;活性MMP一9的表达量下降，为未刺激组的113%和168%、1 73%和145%、0%和0%、131%和112%、0%和0%。 ELISA检测hRPE上清MMP一2结果显示:正常hRPE近融合期，其上清中MMp一2的含量为1 7.32士4.13ng·(ml·lo6eellsI‘，IL一lp和TNF一a作用后，其上清中MMP一2的含量升高，分别为31 .76士6.46ng·(ml·106eells)”和35.09士5.37ng·(ml·lo6eells丫’。联合使用IL一lrA、geni