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背景:药物、材料与干细胞的交互作用是目前组织工程领域的研究的特点和热点,而对能发挥干细胞特定功能的药物、材料的高通量筛选是目前的研究难点,因此,亟需一种快速的、准确的动态分析方法来进行药物和材料的高通量筛选。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有强增殖和多向分化能力,是当前组织工程、生物医学、材料和其他众多领域常用的干细胞亚型和研究的热点。特定微环境下BMSCs的定向分化以满足特定功能是其成功应用的重要前提,因此,评估BMSCs的成骨分化在骨、牙周组织工程应用中非常重要。然而,传统评价方法具有耗时较长、早期评价效果不佳等特点,阻碍了小分子药物、细胞因子和生物材料的高通量筛选。在成骨分化过程,BMSCs一方面伴随着细胞体积的增大和程序性的细胞骨架重塑;另一方面,细胞粘附区和细胞骨架纹理对细胞的直接调控也极大影响了成骨分化水平。因此,BMSCs的形态表型为成骨分化预测提供了宝贵的信息。以往研究表明能够基于机器学习和细胞形态学对BMSCs成骨分化表型进行成功预测,但传统机器学习方法在数据处理和参数优化方面需要进行人工特征提取,需要较高的数理和计算机专业知识,对生物学或医学工作者来说缺乏通用性。近年来,广泛交叉研究应用的深度学习（Deep Learning）方法可以避免这些人工特征提取过程,并实现较好的分类及预测效果。目前,深度学习结合细胞图像学的方法已经成功地应用在预测细胞衰老,神经干细胞分化,以及药物筛选过程中,并取得了非常好的效果。因此,深度学习方法可能是一种准确的、早期的、单细胞分辨率的评估、预测BMSCs成骨分化的手段,但在既往并无人研究。目的:本研究旨在将深度学习技术与干细胞成骨分化过程中表型变化相结合,通过学习、建模来达到成骨分化表型的动态分析并初步探索模型在药物、材料的高通量筛选中的应用前景。本研究拟1.建立在成骨分化早期不同阶段的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的高内含（high-content）图像学动态数据库;2.基于该数据库,建立基于单细胞图像学的深度学习模型,实现高效、准确的干细胞成骨分化动态表型的分析预测;3.将该深度学习模型应用于成骨向小分子药物、材料的筛选。方法:1.rBMSCs成骨分化过程中单细胞图像数据库的建立:本研究采用激光共聚焦显微镜（LSCM）拍摄的方式,捕捉rBMSCs早期成骨向分化期间（第0、1、4和7天）的细胞骨架微丝（F-actin）和细胞核（DAPI）染色的高内含（high-content）细胞图像,建立单细胞图像学动态数据库。具体方法包括:（1）大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的提取、收集、培养、鉴定;（2）rBMSCs不同时间点的成骨诱导;（3）激光共聚焦显微镜拍摄荧光染色图像;（4）计算机平台下单细胞图像的获取及图像的预处理。2.构建OCNN计算模型:采用深度学习方法,对单细胞图像数据库进行训练、验证和测试。具体方法包括:（1）动态单细胞图像数据集的t-SNE流形表征;（2）利用三种深度学习模型（VGG-16、Inception V3和Res Net-50）对单细胞图像数据集进行迁移学习、训练;（3）采用Sensitivity、Specificity、Precision、F1-Score、Accuracy和AUC验证模型效果并进行模型筛选,筛选出的性能最佳的模型命名为OCNN（Osteogenic Convolutional neural network）;（4）采用独立测试集进一步验证OCNN。3.OCNN与传统生化标记以及基线机器学习模型的验证和对比:通过传统的生化标记对OCNN的分类及预测结果进行验证,并将OCNN的分类预测效果与单细胞形态学指标及支持向量机模型进行对比。具体方法包括:（1）成骨分化预测分数（Predicted Osteogenic Score,POS）的计算;（2）rBMSCs成骨分化过程中进行q RT-PCR、流式细胞术、免疫荧光染色三种检测;（3）Cellprofiler提取单细胞形态学指标及相关性计算;（4）支持向量机（SVM）机器学习模型的建立。4.OCNN判读不同刺激条件下rBMSCs成骨分化情况:本研究探究了OCNN对可溶性小分子药物成骨诱导能力的剂量相关性预测;探究了OCNN及基于OCNN的在线学习（Online Learning）在不同材料表面成骨分化预测的性能。具体方法包括:（1）不同浓度的4种小分子药物成骨诱导rBMSCs图像数据的获取、OCNN早期预测的POS值与茜素红染色结果对比拟合;（2）SEM进行材料表征,分别是:细胞爬片、HA、Col-I、DOPA、Amyloid Fibrils、Ti Smooth、Ti Micro以及Ti Nano;（3）材料表面细胞图像学数据的获取;（4）OCNN和基于OCNN的在线学习早期分类效果的对比。结果:1.本研究成功构建了单细胞图像学动态数据库,并建立了高效、准确的干细胞成骨分化状态的预测的深度学习模型——OCNN。经过10折交叉验证后,OCNN在第1、4、7天的平均AUC分别为0.936、0.953和0.967,即在早期便达到了非常好的预测分类能力。此外,OCNN在独立的外部数据集上进行了测试,结果较好,AUC在第1、4和7天分别达到了0.919、0.850和0.906。2.通过传统的生化标记对OCNN的分类及预测结果进行验证:（1）对比成骨基因,各个天数训练出的OCNN输出的细胞群体平均POS从第1天开始明显上调（n=3,50个细胞每组,p＜0.001）,表明OCNN具有早期预测分类的敏感性;（2）0,4和7天的OCNN预测结果和流式细胞术趋势一致;（3）对Runx2蛋白的核/质比与POS进行了相关分析,结果表明两者有显著的相关性（p＜0.05）,关系适中（r=0.4978）。3.与单细胞形态学指标及支持向量机模型相比,OCNN在第1天就取得了0.998的AUC,高于支持向量机（AUC=0.807）和单细胞形态参数（AUC从0.579到0.775）。此外,OCNN的优势在第4天（AUC=0.993）和第7天（AUC=0.972）仍然保持。4.OCNN判读不同刺激条件下rBMSCs成骨分化情况:（1）四种小分子药物辛伐他汀、阿仑膦酸钠、1α,25-二羟基维生素D3（VD3）和BMP-2在早期阶段（24h）的OCNN成骨分化预测值POS与体外中晚期的成骨情况之间存在明显的相关性（p＜0.05）,且关系密切（r=0.9407,0.9257,0.8411和0.9090）。（2）通过对基线OCNN模型进行在线学习,对除对照组外的7种材料表面培养的细胞在早期阶段（24h）进行预测,AUC从0.740（Ti Smooth组）、0.784（Ti Micro组）、0.401（Ti Nano组）、0.460（Col-I组）、0.797（HA组）、0.698（Amyloid Fibrils组）和0.424（DOPA组）增加到0.868、0.896、0.673、0.946、0.799、0.851和0.992。结论:本研究成功构建了成骨分化早期不同阶段rBMSCs的高内含图像学动态数据库,在此基础上建立了基于单细胞图像学的深度学习模型OCNN,实现了干细胞成骨分化表型的准确动态分析和判定。并且,本研究成功地将OCNN和基于OCNN的在线学习方法应用于成骨向小分子药物、材料的筛选。本研究初步证明了OCNN在成骨向小分子药物和生物材料筛选中的前景,为下一代组织工程和干细胞研究提供思路。