小麦条锈病是由专性寄生真菌——条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的一种严重危害小麦生产的流行性真菌病害,对全球小麦生产造成了巨大的经济损失。为实现小麦条锈病的持久防控,寻找新的能有效激发小麦防卫反应的基因资源是主要措施之一。此前多项研究报道类枯草杆菌蛋白酶(subtilases,SBTs)可以在植物—病原互作过程中诱导寄主的过敏性坏死反应(HR)和系统获得抗性(SAR),在植物抗病反应中起到重要作用。然而,关于植物类枯草杆菌蛋白酶家族基因在与活体营养专性寄生真菌互作的报道较少,尤其是小麦-条锈菌互作方面。本试验室前期研究发现一个小麦类枯草杆菌蛋白酶TaSBT1可能参与小麦-Pst非亲和互作,但编码该蛋白的基因特性及其具体的功能和作用方式尚不清楚。本研究主要利用生物信息学分析、亚细胞定位技术、病毒诱导的基因沉默、qRT-PCR等方法对编码该蛋白的基因TaSBT1的基本特性和功能进行了研究。研究结果为丰富小麦信号传递途径,揭示小麦抗条锈病分子机理奠定了理论基础。主要研究结果如下:1、TaSBT1基因的基本特性:TaSBT1在小麦基因组中具有三个同源序列TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d,分别位于小麦4A、4B、4D染色体上,TaSBT1a开放阅读框长2,304 bp,编码767个氨基酸,其编码蛋白分子量为78.47 kD,理论等电点为5.79;TaSBT1b的ORF长2,310 bp,编码769个氨基酸,其编码蛋白分子量为78.61 kD,理论等电点为5.99;TaSBT1d的ORF长2,295 bp,编码764个氨基酸,其编码蛋白分子量为78.25 kD,理论等电点为5.71。TaSBT1编码蛋白由信号肽、原结构域、类枯草杆菌蛋白酶结构域、蛋白酶相关结构域构成,与许多植物的类枯草杆菌蛋白酶亲缘关系较近,与山羊草同源序列相似性高达99%。预测发现三个TaSBT1同源蛋白均具有N端信号肽,并且利用酵母信号肽筛选系统成功验证了其编码蛋白信号肽的分泌功能,亚细胞定位结果也同时证明了TaSBT1蛋白定位于细胞质膜外侧。2、TaSBT1基因功能:通过qRT-PCR技术分析TaSBT1基因在小麦与条锈菌的互作中的表达特征,结果显示TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d均在非亲和互作中的12—24 h之间有强烈的上调表达,其中TaSBT1b在接种后12 h表达量最高为对照的7.2倍,TaSBT1a、TaSBT1d分别为对照的4.3倍、6.2倍;三者在接种后24 h也显著高于对照,为未接种对照的2.5倍;而在亲和互作中表达量无显著变化。由此推测TaSBT1基因可能参与小麦对条锈菌的防御机制。采用农杆菌瞬时表达技术在烟草叶片中超量表达TaSBT1基因可以诱发植物细胞死亡,表明TaSBT1蛋白参与植物抗病反应中的PCD反应。进一步利用BSMV介导的基因沉默技术,选取目的基因的2个特异片段对小麦中的TaSBT1基因进行沉默,接种条锈菌非亲和小种CYR20的对照小麦叶片观察到明显的过敏性坏死,但沉默植株产生大量的夏孢子堆;接种亲和小种CYR33的小麦叶片观察到目的基因沉默植株与对照相比产孢量无明显变化,均产生大量夏孢子堆,并且通过台盼蓝染色发现后期沉默植株坏死面积相比对照植株减少。qRT-PCR分析证明沉默植株在接种CYR20和CYR33后,TaSBT1基因表达量均有不同程度下降。进一步说明TaSBT1基因沉默植株对CYR20的抗性显著下降。3、TaSBT1基因可能参与的抗病信号途径:通过外源激素SA、MeJA、ETH处理发现TaSBT1a、TaSBT1b、TaSBT1d基因均在SA处理0.5 h后被诱导上调表达,而在MeJA和ETH诱导后无显著变化,由此推测TaSBT1基因可能参与水杨酸信号转导途径。另外,利用TaSBT1的同源蛋白AtSBT1.7蛋白进行STRING预测,发现互作可能性较高的蛋白有果胶甲酯酶抑制剂PMEI(AT2G47670)、白细胞介素-I-受体家族蛋白酶(AT2G17055)、类受体激酶BAM1(MPA24.5)、粘液质修饰蛋白(MUM2)和AAA型ATP酶家族蛋白(AT3G24530)。通过测定PME活性验证TaSBT1和PMEI的作用,发现TaSBT1基因沉默叶片的粗蛋白酶液与对照植株相比在钌红染色的琼脂糖凝胶培养基上显现更浅的颜色,暗示其PME活性提高。由此说明TaSBT1可以通过调节植物PME活性来影响植物抗病性,且TaSBT1基因沉默植株的PME活性降低,暗示TaSBT1基因可以提高植株PME活性。综上所述,TaSBT1基因编码类枯草杆菌蛋白酶,该基因参与小麦与条锈菌非亲和互作过程,并调控小麦对条锈菌的抗病性。本研究为深入了解类枯草杆菌蛋白酶参与调控小麦对条锈菌免疫应答的分子机制奠定理论基础,对持续全面防治小麦条锈病具有重要的理论意义。