近年来,随着中国经济的快速发展和人民生活水平的不断提高,人们对肉、蛋、奶等的需求量也在逐年增加,从而进一步促进了畜禽养殖业的蓬勃发展。然而于此同时,家禽和家畜也是致病性大肠杆菌最重要的宿主来源;尤其是随着现代牧业规模化养殖中抗生素的大量使用,包括致病性大肠杆菌在内的多种微生物在药物的不断筛选作用下,其耐药性逐渐增强并不断出现新的耐药基因。为此,很多国家或地区都建立了多种监控和调查研究系统以期最大限度地降低和减少细菌耐药性,其中就包括通过对细菌的表型水平(如流行病学调查)和基因水平(如全基因组测序)的研究进一步了解其耐药性的进化、形成以及传播机制等。粘菌素一直被认为是治疗多种细菌性感染的最后一道防线,但是近期多种粘菌素的耐药基因(mcr-1,mcr-2,mcr-3,mcr-4,mcr-5)被发现,给人类和动物的健康带来了巨大的威胁。一、大肠杆菌耐药性检测在2004-2012年间,相关人员从临床送检动物鸡、鸭、猪、牛等中共分离培养862株致病性大肠杆菌,并通过18种药敏纸片对其耐药性进行了检测。其中94%的菌株表现为至少对一种药物耐药,83%的菌株对3种以上的药物耐药。绝大部分的菌株对四环素、萘啶酸、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氨苄西林等药物耐药;同时这些致病性大肠杆菌随着时间的推移其对阿米卡星、氨曲南、头孢他啶、头孢噻肟、氯霉素、环丙沙星等抗生素的耐药性有逐渐增强的趋势;而对药物阿莫西林/克拉维酸(3.4%)和厄他培南(0.2%)的表现出耐药的菌株相对较少。本研究同时发现在不同种动物中多重耐药的现象较为普遍,如鸭(44/44,100%)、鸡(568/644,88.2%)、猪(93/133,82.3%)、牛(13/61,21.3%)。二、大肠杆菌分离株的基因组测序为了进一步从基因水平上了解本研究中获得的致病性大肠杆菌分离株,我们根据分离株的背景信息从中选取19株来源于鸡、猪、牛、鸭等动物的菌株进行了基因组框架图的测定,并通过相关序列分析软件对测定的基因组序列进行了耐药性、致病性等相关特性的分析。其中78.9%的分离株携带有29种对12种不同药物表现为耐药的基因;所有19株大肠杆菌分离株携带至少1种耐药基因;其中一株大肠杆菌携带有粘菌素耐药基因mcr-1。于此同时,我们从其中的15(15/19,78.9%)株细菌中共检测到13种质粒。三、中国mcr-1基因的分子流行病学为了解粘菌素耐药基因mcr-1在中国的流行现状,本研究建立了一种特异性检测mcr-1基因的荧光定量PCR方法;同时,为了定量样品中细菌的相对含量,本研究建立了一种可以同时检测所有细菌的荧光定量PCR方法。本研究在中国采集样品的25个省份或直辖市中的21个省市自治区中检测到了 mcr-1阳性样品;在不同动物来源的样品中,猪的鼻腔和肛门拭子样品阳性率最高(1,128/1,389,81.2%),其次为犬的肛门拭子样品(14/40,35.0%),家禽的咽喉和泄殖腔拭子样品(899/3,318,27.1%),女性阴道拭子样品(1/134,0.7%),本研究未在牛的粪便拭子中检测到mcr-1耐药基因(0/64)。通过两种荧光定量PCR方法对样品中mcr-1基因和总细菌进行定量后发现其比值在不同种样品中差异较大,如在犬肛门拭子中为31.6%,在家禽咽喉拭子为0.4%、泄殖腔为1.7%,在猪肛门和鼻腔中为0.1%,而在女性阴道拭子中为0.0008%。mcr-1基因在猪的鼻腔和肛门拭子中、家禽的咽喉和泄殖腔拭子中的流行率未表现出显著性差异,从而表明携带mcr-1基因的细菌可能存在于多种微生物环境中。同时,通过对样品中mcr-1基因和总细菌的比值分析后发现,在相关的环境中细菌携带mcr-1基因的比例较高。四、家蝇和绿头苍蝇在mcr基因传播中的作用本研究通过对粘菌素耐药基因mcr-1、mcr-2、mcr-3序列进行比对后,选取其中保守区间设计引物并建立了分别特异性检测mcr-1、mcr-2、mcr-3基因的荧光定量PCR方法,且这些qPCR方法具有高度的特异性和灵敏性,其最低可以在单个反应孔中检测到单个拷贝的核酸分子。通过这些荧光定量PCR方法对采集的297份苍蝇样品(252份家蝇Muscadomestica、45份绿头苍蝇Protophormia terraenovae)及从中分离的189株细菌样品中粘菌素耐药基因的流行现状进行了调查。结果显示:34.1%的家蝇(46/252)和51.1%的绿头苍蝇(23/45)表现为mcr-1阳性,1.2%的家蝇(3/252)和2.2%的绿头苍蝇(1/45)表现为mcr-2阳性,5.2%的家蝇(13/252)和44.4%的绿头苍蝇(20/45)表现为mcr-3阳性;同时,有9(9/189,4.8%)株细菌样品表现为mcr-1阳性,包括Escherichia coli:8.3%,4/48;Enterobacter cloacae:12.5%,1/8;Providencia alcalifaciens:11.8%,2/17;Providencia stuartii,4.9%,2/41。但是,本研究未从细菌分离株中检测到mcr-2和mcr-3的核酸。通过对mcr-1阳性的细菌分离株进行粘菌素MIC检测后发现,其中的4株细菌(2株P.stuartii,2株P.alcalifaciens)MIC浓度大于4mg/ml的药物浓度。截止目前,这是第一次在Provideniaa细菌中检测到mcr-1耐药基因,同时也是mcr-2和mcr-3在其分别在比利时和中国发现后的证实性报道。五、致病性大肠杆菌中mcr基因的检测和传播特性的研究本研究进一步通过建立的多种荧光定量PCR对收集于2004-2012年间的624株致病性大肠杆菌分离株进行了检测;同时,通过将mcr,-1阳性菌株和阴性菌株在有无粘菌素的条件下进行传代共培养从而探究耐药基因的转移、丢失等问题。在所有分离株中有17株(17/624,2.7%)大肠杆菌为mcr-1阳性,但mcr-2和mcr-3均为阴性;同时,mcr-1基因在不同宿主来源的大肠杆菌中的阳性率未表现出显著性差异,如鸡(14/404,3.2%)、猪(1/113,0.9%)、鸭(3/44,6.8%)等。通过对mcr-1阳性菌株和阴性菌株共培养并传代6次(等同于60代)后仍然可以从中检测到mcr-1核酸,而且在有无添加粘菌素的情况下都是同样的结果。本研究一方面进一步证实了 mcr-1粘菌素在中国食用性动物来源致病性大肠杆菌中存在的事实,同时也证明其具有在粘菌素停止使用之后任然存在和转移的特性。综上所述,本研究证实:临床上从家禽和家畜中分离获得的致病性大肠杆菌表现为多重耐药且同时携带有多种耐药基因;同时,粘菌素耐药基因mcr-1在中国多种动物中广泛分布,如鸡、鸭、鹅、猪等。同时,生活中常见的苍蝇这样一种昆虫在mcr耐药基因的储存和传播中可能扮演着重要角色,如将耐药基因在不同的宿主环境间进行传播。于此同时,本研究在食源性动物来源的致病性大肠杆菌中检测到了 mcr-1耐药基因,并证实其具有在去除粘菌素后仍然可以继续存在和转移的可能性,这就为我们的食品安全和公共卫生安全带来了巨大威胁。